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大丽轮枝菌V07DF2 T-DNA插入突变体库的构建及表型变异突变体的筛选

作　者: 王彩月
导　师: 赵明文；林玲
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 大丽轮枝菌农杆菌介导的转化双向启动子捕获载体插入突变体库
分类号: S432.42
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是一种引起棉花、茄子等多种作物黄萎病的土传病原真菌。目前,对该病菌致病的分子机理研究还不够深入,病原菌与作物之问的相互识别机制也仍然不够明了,对该病的防治也未有显著的成效。本研究旨在为深入解析大丽轮枝菌的分子致病机理奠定基础。以江苏省棉花黄萎病菌的代表菌株强致病力落叶型菌株V07DF2和中等致病力非落叶型菌株Bp2为对象,建立了农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT),对这两株大丽轮枝菌,进行了绿色荧光蛋白的标记。将经改造而成的荧光标记载体1300-HYG-sGFP,通过ATMT方法将其T区整合入大丽轮枝菌基因组中,并且通过对ATMT法的修改,使最终转化效率达到0.1%～0.2%,即106个孢子可转化长出1000～2000个转化子。通过对转化子进行筛选,获得荧光表达较强并性状稳定的转基因菌株,然后接种拟南芥,观察其侵染过程。结果表明,被荧光标记的菌株在细胞、组织层面上均可以很好的反应不同侵染阶段的特征。荧光标记大丽轮枝菌的研究为建立稳定的大丽轮枝菌遗传转化体系奠定了基础,同时也为深入探寻该病原菌侵染和致病机理积累了研究材料。由于T-DNA插入突变是随机的,其中包含了大量的无意突变。启动子捕获技术(promoter trap)是在T-DNA区域的边界附近构建一个无启动子的报告基因(如GFP),该元件和选择标记基因一起组成捕获载体。T区两侧的报告基因只要插入到受启动子启动的区域或与未知基因发生正确的融合表达,该报告基因就被激活,从而可以避免无意义的插入突变。我们在已经建立的ATMT方法基础上,构建双向GFP启动子捕获载体,将其转入大丽轮枝菌V07DF2中,构建V07DF2T-DNA插入突变体库,共保存了6000个突变体。双向启动子捕获载体T-DNA区两端分别含有GFP的ORF和终止子,中间有潮霉素抗性盒子和质粒拯救元件。没有启动子的GFP序列可以捕获表达基因的启动子,潮霉素抗性盒子用于筛选转化子,而质粒拯救元件有利于获得T-DNA插入位点的序列片段。随机选择突变体,进行分子实验分析,判断载体各片段的功能,以保证双向启动子捕获载体的有效性。T-DNA插入突变体库中突变体在保存前都需经过单孢分离,以防止交叉污染,同时保证每个突变体T-DNA的稳定整合。在大丽轮枝菌V07DF2T-DNA插入突变体库中,随机选择1000个突变体进行表型分析,筛选指标为菌落生长速度、菌丝形态、产色素情况、产孢能力和菌丝荧光强度,以验证突变体库的效能。结果筛选获得108个表型变异的突变体,其中有4株菌落直径显著变小(即生长减慢),2株菌丝变致密,2株菌丝变疏松,2株产紫黑色色素,38株产孢能力变化,65株具绿色荧光,有些在同一菌株中出现多种表型变异。对其中62株明显表型变异的突变体再进行致病力测定,筛选出4株致病力丧失的突变体和10株致病力减弱的突变体。这些突变体的获得将为揭示大丽轮枝菌的致病和生长发育的分子机理奠定基础。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
名词缩写  10-11
第一章文献综述  11-25
  1.1 棉花黄萎病的研究进展  11-13
    1.1.1 棉花黄萎病的发现、分布及危害  11
    1.1.2 棉花黄萎病的症状  11-12
    1.1.3 棉花黄萎病的防治措施  12-13
  1.2 大丽轮枝菌的研究进展  13-17
    1.2.1 大丽轮枝菌的特性  13-14
    1.2.2 大丽轮枝菌的致病机理  14-15
    1.2.3 大丽轮枝菌的致病相关基因  15-17
  1.3 真菌的遗传转化  17-23
    1.3.1 真菌遗传转化的方法  17-18
    1.3.2 农杆菌介导转化方法(ATMT)的研究进展  18-20
    1.3.3 启动子捕获技术在基因克隆中的应用  20-21
    1.3.4 绿色荧光蛋白在真菌研究中的应用  21-22
    1.3.5 质粒拯救方法在基因克隆中的应用  22-23
  1.4 研究目的与意义  23-25
第二章大丽轮枝菌的ATMT法的建立  25-45
  摘要  25
  2.1 材料与方法  25-37
    2.1.1 质粒、菌株和植物材料  25-26
    2.1.2 相关试剂及其配制  26-29
    2.1.3 荧光标记载体的构建  29-35
    2.1.4 ATMT法转化大丽轮枝菌菌株  35-36
    2.1.5 观察荧光标记菌株的定殖侵染  36-37
  2.2 结果与分析  37-40
    2.2.1 构建荧光标记载体1300-HYG-sGFP  37-39
    2.2.2 大丽轮枝菌菌株对潮霉素(Hyg)的抗性检测  39
    2.2.3 荧光标记大丽轮枝菌菌株V07DF2和Bp2  39-40
    2.2.4 大丽轮枝菌sGFP荧光标记菌株侵染植物根部时的定殖观察  40
  2.3 讨论  40-45
第三章双向启动子诱捕载体的构建和功能验证  45-57
  摘要  45
  3.1 材料和方法  45-50
    3.1.1 质粒和菌株  45
    3.1.2 相关试剂及其配制  45-46
    3.1.3 双向启动子捕获载体的构建  46-48
    3.1.4 载体功能验证  48-50
  3.2 结果和分析  50-55
    3.2.1 双向启动子捕获载体的构建  50-52
    3.2.2 双向启动子捕获载体转入V07DF2  52
    3.2.3 双向启动子捕获载体T-DNA区功能验证  52-55
  3.3 讨论  55-57
第四章大丽轮枝菌菌株V07DF2 T-DNA插入突变体库的构建和部分突变体表型筛选  57-73
  摘要  57
  4.1 材料和方法  57-60
    4.1.1 菌株和植物材料  57-58
    4.1.2 相关试剂及其配制  58
    4.1.3 构建突变体库  58-59
    4.1.4 根系物质对大丽轮枝菌产孢子的影响  59
    4.1.5 表型变异突变体的筛选  59
    4.1.6 变异突变体的致病力鉴定  59-60
  4.2 结果和分析  60-68
    4.2.1 用双向启动子捕获载体构建V07DF2 T-DNA插入突变体库  60-61
    4.2.2 查氏-根培养基促进大丽轮枝菌分生孢子的产生  61-62
    4.2.3 表型变异突变体的筛选  62-66
    4.2.4 变异突变体的致病力鉴定  66-68
  4.3 讨论  68-73
全文总结  73-75
参考文献  75-83
致谢  83

大丽轮枝菌V07DF2 T-DNA插入突变体库的构建及表型变异突变体的筛选

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