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放线菌产安莎类和环醇类抗生素合成基因资源的挖掘

作　者: 凡琴
导　师: 宋思扬
学　校: 厦门大学
专　业: 微生物学
关键词: 基因挖掘安莎类氨基环醇类基因组扫描
分类号: Q939.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

放线菌是各种天然活性化合物的重要来源。传统的天然产物获得方法需要对菌株的发酵产物进行逐级分离,存在周期长、效率低且难以预知产物具体结构类型等问题,而新兴的分子生物学和生物合成技术可以用于指导从微生物中分离特定类型的活性化合物。本论文以本课题组从不同来源材料中分离到的830株放线菌为基础,应用基因挖掘的方法,从中筛选出了具有产生安莎类、氨基环醇类活性化合物潜能的菌株。根据这两类化合物特殊合成单元生物合成过程中的蛋白酶氨基酸序列设计简并引物,从不同菌株的基因组DNA中通过聚合酶链式扩增、产物测序验证的方法筛选出具有相应基因的菌株。根据16SrRNA系统发育树选择其中进化分支独特的菌株进行特异基因的转录水平检测,观察到该基因表达者再采用Southern杂交、基因组扫描分析等方法对其基因资源进行深入详细的探索研究,同时对筛选得到的菌株进行遗传操作条件和发酵培养摸索,以期从其中分离出目的类型化合物。3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)是安莎类抗生素的特殊合成起始单元,完成AHBA合成最后一步的蛋白质是AHBA合酶。我们利用已知引物AHBA-F/R2从菌种库中冻存的600株放线菌中筛选得到16株AHBA合酶基因阳性菌株。在此基础上根据包含丝裂霉素的AHBA合酶蛋白序列保守区域设计得到简并引物AHBA-A’F/CR,从这600株菌中筛选得到新的37株AHBA合酶基因阳性的菌株。此外,利用这对自行设计的引物,从新保存的230株放线菌中筛选出33株AHBA合酶基因阳性的菌株。这些阳性菌株的PCR产物测序比对后都与Genbank中已知AHBA合成酶基因同源,且具有丰富的多态性。对新保存菌株中的33株AHBA合成酶基因阳性菌株构建16S rRNA系统发育树,选择其中22株进化分支独立者进行了AHBA基因转录水平检测,结果表明A00941、A009682株菌在该条件下表达了AHBA基因。以AHBA为底物对A00941、A00968进行前体喂养实验,发酵产物的HPLC检测分析结果显示若干产物峰在喂养后出现或增高。选择基因表达水平较高的菌株A00941进行全基因组扫描测序,发现其中包含合成AHBA的全套基因及连锁的聚酮链合成相关基因簇。目前对A00941菌株的发酵条件优化及产物分离工作正在开展中。在筛选环醇类抗生素产生菌的过程中,根据2-表-5-表-有效醇酮合酶的同源蛋白序列设计得到简并引物CYC-AF/DR,从菌种库中共筛选到20株该基因阳性的放线菌,经过测序比对验证,结果表明其中5株与Genbank中已知的氨基环醇类化合物产生菌的相关合成基因具有同源性,说明这些菌株具有产生氨基环醇类化合物的潜力。以特殊保守酶为探针可以有效地挖掘未知阳性菌株及基因资源,指导新天然产物的分离,促进自然界中新抗生素的发现。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词对照表  12-13
第一章前言  13-28
  1.1 安莎类抗生素生物合成的研究进展  13-25
    1.1.1 安莎类抗生素生物活性及应用价值  14-15
    1.1.2 安莎类抗生素生物合成途径概述  15-18
    1.1.3 安莎类抗生素AHBA合酶功能的研究  18-19
    1.1.4 安莎类抗生素生物合成基因簇研究  19-25
  1.2 C_7N氨基环醇类抗生素  25-27
    1.2.1 氨基环醇类抗生素及其应用价值  25-26
    1.2.2 氨基环醇类生物合成途径概述  26-27
  1.3 本文研究策略及目的  27-28
第二章材料与方法  28-49
  2.1 实验材料  28-36
    2.1.1 用于筛选的菌种库菌株  28
    2.1.2 其它菌株  28-29
    2.1.3 质粒  29
    2.1.4 引物  29-31
    2.1.5 试剂盒及工具酶  31
    2.1.6 培养基  31-33
    2.1.7 实验试剂  33-35
    2.1.8 主要仪器  35-36
  2.2 实验方法  36-49
    2.2.1 放线菌菌种的活化及保藏  36
    2.2.2 放线菌总DNA的少量快速提取  36-37
    2.2.3 放线菌总DNA的制备(大量提取)  37
    2.2.4 简并引物的设计  37-38
    2.2.5 PCR扩增反应体系及条件  38-39
    2.2.6 PCR扩增产物的回收、克隆及序列测定  39-40
    2.2.7 Inoue法制备大肠杆菌感受态  40
    2.2.8 16S rRNA系统发育树的构建  40-41
    2.2.9 AHBA合酶基因转录水平检测(RT-PCR)  41-43
    2.2.10 培养基对特定基因表达量的影响  43-44
    2.2.11 Southern杂交  44-47
    2.2.12 两亲本介导的质粒DNA的跨属接合转移及初步验证  47
    2.2.13 基因组扫描  47-48
    2.2.14 生物信息学分析  48-49
第三章结果与分析  49-77
  3.1 待测菌株基因组DNA的提取  49
  3.2 安莎类抗生素生物合成基因资源的挖掘  49-74
    3.2.1 引物AHBA-F/R2的筛选结果  50-54
    3.2.2 引物AHBA-A'F/CR的筛选结果  54-61
    3.2.3 AHBA合酶基因阳性菌株者的16S rRNA系统发育树  61-62
    3.2.4 AHBA合酶基因转录水平检测  62-65
    3.2.5 A00968的接合转移条件  65-67
    3.2.6 A00968的Southern杂交  67-69
    3.2.7 培养基对A00941中AHBA合酶基因表达量的影响  69-70
    3.2.8 A00941基因组DNA扫描结果分析  70-74
  3.3 氨基环醇类抗生素生物合成基因资源的挖掘  74-77
    3.3.1 氨基环醇类简并引物的设计  74
    3.3.2 引物CYC-AF/DR的筛选结果  74-75
    3.3.3 氨基环醇类阳性菌株PCR产物序列测定及比对分析  75-77
第四章讨论与结论  77-82
  4.1 设计简并引物从基因水平筛选阳性菌株  77-78
  4.2 引物AHBA-A'F/CR与引物AHBA-F/R2的对比分析  78-79
  4.3 RT-PCR检测特定基因的转录水平  79-80
  4.4 大肠杆菌与马杜拉放线菌间的接合转移  80
  4.5 AHBA合酶基因阳性菌株基因组序列中目的基因簇分析  80-82
第五章总结与展望  82-83
  5.1 工作总结  82
  5.2 工作展望  82-83
参考文献  83-92
致谢  92-93

放线菌产安莎类和环醇类抗生素合成基因资源的挖掘

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