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埃博拉病毒糖蛋白的毒性研究

作　者: 赵晨
导　师: 蒋澄宇
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 埃博拉病毒 糖蛋白 GP1 细胞漂浮
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


埃博拉病毒是一种丝状病毒科单股负链无节段的RNA病毒。该病毒可导致埃博拉出血热,多表现为高热、休克及出血倾向。在疾病发展过程中,埃博拉病毒可损害血管内皮,进而导致血管通透性增加。目前己确定埃博拉病毒的毒性主要源自其表面的糖蛋白(GP)。内源性表达该蛋白可以导致血管内皮细胞失去粘附能力而脱落、漂浮,从而损害血管的完整性。本室建立了外源性携带Fc标签的糖蛋白GP1亚基(GP1-Fc)导致血管内皮细胞漂浮的模型。为进一步明确该模型中GP1-Fc毒性相关的结构域,本研究构建并表达、纯化了GP1相关的系列蛋白。同时发现了外源性添加的GP1-Fc蛋白以多聚体的形式存在,可能存在模拟天然GP分子构象的情况。此外,本研究还证实了在293T细胞中内源性表达GP不会直接导致细胞死亡。

全文目录


摘要  9-10
Abstract  10-11
英文缩略语表  11-13
前言  13-15
第一部分 GP系列质粒的构建  15-40
  1 实验材料  15-25
    1.1 质粒  15-20
    1.2 菌株  20-21
    1.3 细胞株  21
    1.4 工具酶、酶切缓冲液  21
    1.5 主要化学试剂  21
    1.6 细胞培养用耗材  21
    1.7 试剂盒  21
    1.8 主要仪器及设备  21-22
    1.9 主要溶液配方  22-24
    1.10 主要抗体  24
    1.11 PCR引物  24-25
  2 实验方法  25-31
    2.1 质粒构建  25-29
    2.2 细胞相关实验  29-31
  3 实验结果  31-39
    3.1 构建pEAK13CD5L Mucin TEVhFc质粒  31-33
    3.2 构建pEAK13CD5L GP△TM TEVhFc质粒  33-35
    3.3 构建pEAK13CD5L GP△Mucin TEVhFc质粒  35-37
    3.4 构建pEAK13CD5L GP△Mucin△TM TEVhFc质粒  37-39
    3.5 质粒大量提取  39
  4 结论  39-40
第二部分 Mucin-Fc及GP△TM-Fc稳定表达细胞株的构建  40-44
  1 实验材料  40
  2 实验方法  40-41
    2.1 DNA的纯化回收  40
    2.2 细胞冻存  40
    2.3 细胞复苏  40-41
    2.4 稳定表达细胞株的构建  41
  3 实验结果  41-43
    3.1 Mucin-Fc稳定表达细胞株的构建  41-42
    3.2 GP△TM-Fc稳定表达细胞株的构建  42-43
  4 结论  43-44
第三部分 GP_1-Fc、Mucin-Fc及Fc蛋白的表达及纯化  44-49
  1 实验材料  44
    1.1 试剂与耗材  44
    1.2 主要仪器与设备  44
  2 实验方法  44-45
    2.1 蛋白纯化  44-45
    2.2 蛋白浓度测定  45
  3 实验结果  45-48
    3.1 GP_1-Fc蛋白表达及纯化  45-46
    3.2 Mucin-Fc蛋白表达及纯化  46
    3.3 Fc蛋白表达及纯化  46-47
    3.4 纯化后蛋白的浓度测定  47-48
  4 结论  48-49
第四部分 GP_1-Fc融合蛋白多聚体研究  49-51
  1 实验材料  49
  2 实验方法  49-50
    2.1 线性梯度native-PAGE  49-50
  3 实验结果  50
    3.1 线性梯度 native-PAGE  50
  4 结论  50-51
第五部分 GP细胞毒性相关研究  51-55
  1 实验材料  51
    1.1 试剂与耗材  51
    1.2 主要仪器与设备  51
  2 实验方法  51-52
    2.1 MTS检测细胞活力  51
    2.2 台盼蓝染色法检测细胞死亡  51-52
  3 实验结果  52-54
    3.1 GP转染后细胞漂浮的情况  52-53
    3.2 MTS检测细胞活力的结果  53-54
    3.3 台盼蓝染色法检测漂浮细胞的死亡率  54
  4 结论  54-55
讨论  55-57
参考文献  57-60
综述  60-72
  参考文献  68-72
致谢  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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