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IRF-1调控IFP35表达及抑制BFV复制作用机制初探

作　者: 杨炜
导　师: 耿运琪
学　校: 南开大学
专　业: 微生物
关键词: 牛泡沫病毒 IFP35 核因子κB信号通路干扰素调节因子-1
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

干扰素调节因子(IRFs)和核因子κB (NF-κB)是细胞中两类重要的转录因子,对于细胞的先天免疫应答至关重要。目前在人的细胞中共发现了9个IRFs,即IRF-1到IRF-9。其中,IRF-1是首个被发现的IRFs家族成员,其靶蛋白参与了细胞内多种生物学功能的调控,包括抗病毒、抗增殖及细胞凋亡等。NF-κB能够调控干扰素-p、炎症因子以及白介素等基因的表达,在细胞的免疫应答及炎症反应中发挥着重要的作用。泡沫病毒(FVs)是一类特殊的反转录病毒,与其他反转录病毒相比,FVs的转录调控机制及生活周期具有诸多独特之处。FVs在体外培养的细胞中能够引起强烈的细胞病变,在其天然宿主中却处于潜伏感染状态,并不引发任何症状。目前关于FVs处于潜伏感染状态的具体机制尚不清楚。本室前期研究发现牛泡沫病毒(BFV)通过激活HeLa细胞的NF-κB通路上调了RelB的表达,RelB作为BFV反式激活因子BTas的辅因子增强了BTas介导的对LTR的反式激活作用,进而促进了BFV的复制。然而,NF-κB的激活并不能使BFV由潜伏感染状态向裂解感染状态转换,推测BFV有可能通过NF-κB激活了其他抗病毒因子。此外,本室前期研究发现,干扰素诱导蛋白IFP35可以抑制BFV的复制,但BFV感染对IFP35表达的影响尚不清楚。本文即对BFV与宿主的相互作用展开了进一步的研究,以期了解BFV活化NF-κB后是否会激活IFP35或其他抗病毒因子的表达,从而为揭示BFV处于潜伏感染状态的机制提供线索。为了便于研究BFV感染对IFP35表达的影响,我们对IFP35的转录调控机制进行了较为详细的分析,发现IFP35可以被IRF-1、IRF-2及组成活化型的IRF-3及IRF-7诱导表达。其中IRF-1可以直接结合在IFP35启动子的干扰素刺激应答元件(ISRE)上,参与了IFP35的组成型表达,并介导了Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素对IFP35的诱导。此外,我们发现虽然IFP35的启动子区域没有NF-κB结合位点,但是NF-κB通路上游的激酶NIK可以通过激活IRF-1,进而通过上述机制上调IFP35的表达水平。鉴于IRF-1在IFP35转录调控中的重要性,我们研究了BFV感染对IRF-1表达的影响,发现在HeLa细胞中BFV的反式激活因子BTas可以通过NF-κB通路上调IRF-1的表达水平。随后,对IRF-1对BFV复制的影响进行分析,发现在HeLa和293T细胞中过表达IRF-1均可以强烈地抑制BFV的复制,且其抑制BFV复制的能力远强于IFP35。此外,与IFP35类似,在293T细胞中过表达IRF-1也可以抑制BTas介导的对LTR的反式激活作用,但是不同于IFP35,IRF-1还可以抑制BTas介导的对内部启动子IP的反式激活作用,表明IRF-1抑制BFV复制的作用并不完全通过诱导IFP35的表达来实现。鉴于IRF-1是一个重要的转录因子,可以调控诸多干扰素诱导基因(ISGs)的表达,这些ISGs共同作用抑制了BFV的复制。因此,我们初步检测了IFITM1、IFITM3、EFIT3、ISG15和MxA等IRF-1的靶蛋白对BFV复制的影响,结果显示上述ISGs对BFV的抑制作用并不十分显著,不是IRF-1抑制BFV复制过程中发挥关键作用的ISGs。综上所述,本研究发现BFV感染后,病毒在活化NF-κB通路促进自身基因表达的同时,触发了细胞的天然免疫防御机制,细胞通过上调IRF-1的表达,强烈地抑制BFV的复制；IFP35是IRF-1行使抑制作用的效应基因之一；IRF-1是BFV在HeLa细胞中处于潜伏感染状态的重要原因。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
目录  9-13
第一章引言  13-44
  第一节泡沫病毒  13-21
    1.1.1 泡沫病毒的基本生物学特征  13-15
    1.1.2 泡沫病毒的基因表达调控  15-20
      1.1.2.1 泡沫病毒反式激活因子Tas概述  16-19
      1.1.2.2 泡沫病毒基因表达时序模型  19-20
    1.1.3 泡沫病毒的宿主范围及致病性  20-21
  第二节病毒及其诱导的先天免疫应答  21-42
    1.2.1 病毒诱导干扰素和炎症因子产生的机制  22-35
      1.2.1.1 宿主模式识别受体(PRR)介导的信号通路  22-25
      1.2.1.2 干扰素调节因子家族(IRFs)  25-32
        1.2.1.2.1 IRF-1概述  25-29
          1.2.1.2.1.1 IRF-1的表达及活性调节  25-27
          1.2.1.2.1.2 IRF-1与病毒的相互作用  27-28
          1.2.1.2.1.3 IRF-1的其他功能  28-29
        1.2.1.2.2 IRF-2概述  29-30
        1.2.1.2.3 其他IRFs概述  30-32
      1.2.1.3 细胞的NF-κB信号通路  32-35
        1.2.1.3.1 NF-κB信号通路概述  32-33
        1.2.1.3.2 NF-κB的经典和非经典通路  33-35
    1.2.2 干扰素的抗病毒活性  35-38
      1.2.2.1 干扰素介导ISGs产生的信号通路  35-37
      1.2.2.2 干扰素诱导蛋白(ISGs)  37-38
    1.2.3 泡沫病毒与宿主先天免疫系统  38-39
      1.2.3.1 FV与NF-κB信号通路  38
      1.2.3.2 FV与干扰素  38-39
      1.2.3.3 FV与干扰素诱导蛋白  39
    1.2.4 IFP35概述  39-41
      1.2.4.1 IFP35的结构与主要功能  39-40
      1.2.4.2 IFP35的表达调控  40-41
      1.2.4.3 IFP35具有抑制BFV复制的作用  41
    1.2.5 小结  41-42
  第三节本研究的目的和意义  42-44
    1.3.1 本研究的前期基础  42
    1.3.2 本研究的目的和意义  42-44
第二章材料与方法  44-57
  第一节实验材料  44-46
    2.1.1 细胞  44
    2.1.2 菌株  44
    2.1.3 质粒  44-46
    2.1.4 主要试剂  46
  第二节实验方法  46-57
    2.2.1 基因操作  46-48
    2.2.2 蛋白的表达纯化  48-49
    2.2.3 细胞培养  49
    2.2.4 细胞转染  49
    2.2.5 蛋白质SDS-PAGE电泳  49-50
    2.2.6 Western Blot  50
    2.2.7 荧光素酶活性测定  50-51
    2.2.8 BFV指示细胞系分析  51
    2.2.9 5'-cDNA末端快速扩增分析  51
    2.2.10 染色质免疫共沉淀  51-53
    2.2.11 电泳迁移率阻滞实验  53-54
    2.2.12 RNA提取及反转录  54-56
    2.2.13 实时定量PCR  56-57
第三章结果  57-93
  第一节 IRF-1介导干扰素对IFP35的诱导表达  57-80
    3.1.1 IFP35转录起始位点及启动子活性分析  57-59
    3.1.2 Ⅰ型和Ⅱ型干扰素通过ISRE激活了IFP35的启动子  59-63
      3.1.2.1 ISRE介导了Ⅰ型干扰素对IFP35启动子的激活  59-61
      3.1.2.2 ISRE介导了Ⅱ型干扰素对IFP35启动子的激活  61-63
    3.1.3 IRF-1通过ISRE激活了IFP35的表达  63-67
      3.1.3.1 IRF-1可以激活IFP35的启动子  63-66
      3.1.3.2 IRF-1通过ISRE激活IFP35的表达  66-67
    3.1.4 IRF-1参与了Ⅰ型干扰素对IFP35的激活  67-69
    3.1.5 IRF-1参与了Ⅱ型干扰素对IFP35的激活  69-75
      3.1.5.1 IFN-γ对IFP35的激活需要IRF-1  69-71
      3.1.5.2 在IFN-γ的刺激下,IRF-1可以结合在IFP35的启动子上  71-72
      3.1.5.3 IFN-γ通过STAT-1/IRF-1通路激活IFP35的表达  72-75
    3.1.6 IRF-1参与了NIK对IFP35的激活  75-78
    3.1.7 IRF-2、组成活化型的IRF-3及IRF-7可以激活IFP35的表达  78-80
  第二节 IRF-1抑制BFV复制  80-93
    3.2.1 BFV感染可诱导IRF-1表达  81-84
      3.2.1.1 BFV感染导致IRF-1表达上调  81-82
      3.2.1.2 BTas通过NF-κB通路激活IRF-1的表达  82-84
    3.2.2 IRF-1抑制BFV复制  84-93
      3.2.2.1 IRF-1可抑制BFV复制  84-87
      3.2.2.2 IRF-1可抑制BFV基因的转录  87-90
      3.2.2.3 IRF-1抑制BFV复制效应基因初探  90-93
第四章讨论  93-99
  第一节 IFP35表达调控及其与BFV感染的关系  93-96
    4.1.1 IFP35启动子顺式作用元件分析  93-94
    4.1.2 IRFs激活IFP35的表达分析  94-95
    4.1.3 BFV感染不影响HeLa细胞内源IFP35表达的可能原因  95-96
  第二节 IRF-1与BFV感染的博弈  96-99
    4.2.1 BFV激活IRF-1表达  96
    4.2.2 IRF-1在宿主抑制BFV复制中的贡献  96-99
第五章结论与展望  99-102
  第一节结论  99-100
  第二节展望  100-102
参考文献  102-115
致谢  115-116
附录1 英文缩写  116-119
附录2 个人简历  119-120
附录3 在学期间发表的论文与研究成果  120

IRF-1调控IFP35表达及抑制BFV复制作用机制初探

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