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乙醇脱氢酶高产菌株的筛选、鉴定及其酶学性质研究

作　者: 江晓颖
导　师: 周常义
学　校: 集美大学
专　业: 微生物学
关键词: 葡糖醋杆菌乙醇脱氢酶筛选发酵优化纯化酶学性质
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase， ADH）通常以NAD^＋、NADP^＋或PQQ为辅酶，是一类氧化还原酶。本研究在筛选ADH高产菌株的基础上，对菌株的发酵条件、ADH提取纯化和酶学性质进行研究，主要研究结果如下：1. ADH高产菌株的筛选。利用产酸显示平板、水解碳酸钙透明圈法和以乙醇为唯一的碳源等筛选模型，筛选出一株ADH产量为4995U/mg，经形态学、生理生化试验、16S rDNA序列分析，鉴定为葡糖醋杆菌，命名为Gluconacetobacter sp. TDY1。2.菌株TDY1生长和产酶条件研究。单因素试验得出优化培养基为1.5%葡萄糖、2.0%复合氮源（酵母膏+牛肉膏）、0.4%氯化钙和0.4%有机酸；菌株生长的培养最佳条件为初始pH6.0、接种量8%、装液量30mL/300mL、25℃条件下培养20h。经Box-Behnken设计优化菌株产酶条件为葡萄糖1.54%、复合氮源2.02%、装液量48.70mL和乳酸0.42%，菌株TDY1酶活达7191U/mg。3.菌株TDY1胞内ADH的提取纯化。分别用超声破碎法、反复冻融法、溶菌酶法和细菌裂解液法等4种不同破壁方法对菌株TDY1进行破壁处理，通过比较细胞的破碎率和ADH的活力，确定适合于菌株TDY1的细胞破壁方法和最佳条件。实验结果表明超声破碎法获得的ADH活力为4004U/mg，破壁率为97.3%，与其他3种方法比较差异极显著（P＜0.01）。使用正交设计对超声破碎法的破壁条件进行优化，超声破碎的最佳条件为：超声9s、间隔18s、破碎总时间75s、功率95W。菌株TDY1中ADH经超声破碎法、硫酸铵盐析沉淀、透析和DEAE-52阴离子交换层析处理后，纯化倍数8.7倍，酶活回收率为38.7％。纯化后的ADH，经SDS-PAGE初步确定其亚基分子量为48KDa。4. ADH的部分酶学性质研究。菌株TDY1的ADH最适氧化反应pH9.0，pH稳定范围8-9；最适反应温度70℃，在10-60℃温度范围酶活稳定。最适底物为正丁醇，不同金属离子对NAD⁺-ADH活性的影响存在较大差异，其中Mn²⁺对酶活有促进作用；Fe³⁺对酶活无促进或抑制作用；K⁺、Na⁺、Mg²⁺等金属离子对酶活有不同程度的抑制作用；Ba²⁺离子使ADH完全丧失活性。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第1章前言  10-19
  1.1 ADH 的国内外研究现状  10-12
    1.1.1 人和动物来源的 ADH  10-11
    1.1.2 植物中的 ADH  11
    1.1.3 微生物来源的 ADH  11-12
  1.2 ADH 的提取纯化  12-13
  1.3 ADH 应用研究现状  13-16
    1.3.1 制作乙醇生物传感器  14
    1.3.2 ADH 在化学工业中的应用  14-16
    1.3.3 ADH 在医药和食品领域的应用  16
  1.4 ADH 的克隆表达  16-17
  1.5 选题依据与意义  17-18
  1.6 研究方案技术路线  18-19
第2章菌种筛选及鉴定  19-29
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 分离样品来源  19
    2.1.2 试剂  19-20
    2.1.3 主要仪器  20
    2.1.4 培养基与缓冲液  20
  2.2 实验方法  20-24
    2.2.1 菌株筛选  20-21
    2.2.2 菌株菌落及个体形态特征鉴定  21
    2.2.3 菌株的分子鉴定  21
    2.2.4 菌株生理生化试验  21-24
  2.3 实验结果和分析  24-27
    2.3.1 高活性乙醇脱氢酶菌株的筛选  24
    2.3.2 菌株 TDY1 的菌落及个体形态特征  24-25
    2.3.3 菌株 TDY1 16S rDNA 序列的同源性分析  25-26
    2.3.4 菌株 TDY1 的生理生化实验结果  26-27
  2.4 讨论  27-29
第3章菌株 TDY1 产 ADH 培养条件的优化  29-49
  3.1 材料  29-30
    3.1.1 试剂  29-30
    3.1.2 主要仪器  30
  3.2 实验方法  30-34
    3.2.1 菌株 TDY1 生产曲线的测定  30-31
    3.2.2 乙醇对于菌株 TDY1 生长及酶活的影响  31
    3.2.3 发酵培养基优化  31-33
    3.2.4 培养条件优化  33
    3.2.5 响应面优化菌株 TDY1 生长及产酶试验  33
    3.2.6 验证试验  33-34
  3.3 实验结果与分析  34-47
    3.3.1 生长曲线的绘制  34
    3.3.2 乙醇对于菌株 TDY1 生长及酶活的影响  34-35
    3.3.3 不同培养基成分对酶活的影响  35-41
    3.3.4 培养条件的选择  41-43
    3.3.5 响应面优化  43-47
    3.3.6 验证试验  47
  3.4 讨论  47-49
第4章分离纯化及酶学性质研究  49-66
  4.1 材料  49-50
    4.1.1 试剂  49
    4.1.2 主要仪器  49-50
    4.1.3 溶液配制  50
  4.2 实验方法  50-55
    4.2.1 ADH 提取方法的选择  50-52
    4.2.2 硫酸铵沉淀饱和度的选择  52-53
    4.2.3 ADH 的透析  53
    4.2.4 ADH 的柱层析  53-54
    4.2.5 电泳  54
    4.2.6 ADH 的酶活性质的研究  54-55
  4.3 实验结果与分析  55-64
    4.3.1 几种不同细胞破壁方法破壁率的测定  55-56
    4.3.2 乙醇脱氢酶活力的测定  56
    4.3.3 破壁方法的选择  56-57
    4.3.4 超声破碎法条件的优化  57-58
    4.3.5 硫酸铵饱和度的选择  58-59
    4.3.6 柱层析结果  59-60
    4.3.7 SDS-PAGE 结果  60-61
    4.3.8 酶学性质研究  61-64
  4.4 讨论  64-66
结论及展望  66-67
致谢  67-68
参考文献  68-74
在学期间发表的学术论文  74

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