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赖氨酸乙酰化调节大肠杆菌NhoA蛋白活性的研究

作　者: 张群芳
导　师: 张先恩
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 蛋白质芯片 CobB 乙酰化/去乙酰化 NhoA 诱变性
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


蛋白质的赖氨酸乙酰化是从细菌到真核生物都普遍存在的一种翻译后修饰。几十年来,研究者们发现赖氨酸乙酰化在真核生物细胞中发挥着许许多多的生物学功能。近几年,在细菌和古生菌中,也发现了这种翻译后修饰的广泛存在。尽管如此,其在原核细胞中的分布范围仍然不太清楚,这点也成为了开展原核系统中赖氨酸乙酰化修饰功能研究的障碍。蛋白质的赖氨酸乙酰化是一种可逆的修饰,主要由蛋白质乙酰转移酶和去乙酰化酶控制。在细菌中,研究最多的去乙酰化酶是与酵母中沉默信息调节蛋白Sir2同源的CobB蛋白。虽然近几年来有关CobB蛋白的功能研究取得了一些进展,但其底物和在细菌中的功能仍然不清楚。首先,我们使用蛋白质组芯片技术筛选到了十五种具有赖氨酸乙酰化修饰的蛋白质,其中的九种可以被大肠杆菌CobB催化去乙酰化,包括N-羟基芳香胺O-乙酰转移酶(NhoA)。我们使用Western blot验证了NhoA的确可以被CobB去乙酰化,并结合质谱分析技术鉴定出NhoA中三个具有可逆的乙酰化修饰的赖氨酸残基。定点突变试验显示了其中两个乙酰化赖氨酸的突变会导致NhoA乙酰化水平的降低。进一步的研究发现,NhoA的N-乙酰转移酶(NAT)活性和O-乙酰转移酶(OAT)活性都会受到这两个乙酰化赖氨酸残基突变的影响。并且,得到了直接的数据,证实CobB对NhoA的去乙酰化作用提高了NhoA在体外的NAT活性。为了进一步阐明体内的赖氨酸乙酰化修饰对NhoA活性的影响,我们对比了cobB基因敲除菌株与野生型菌株NhoA蛋白的乙酰化水平,以及对硝基芳香族化合物的诱变敏感性。结果显示,cobB基因的敲除会导致NhoA乙酰化水平的提高和OAT活性的降低。这些结果说明,可逆的赖氨酸乙酰化修饰在体外和体内条件下都能够调节NhoA的活性。并且,CobB在体外可以通过催化NhoA的去乙酰化提高其NAT活性,在体内,也很可能是通过相同的方式调节NhoA的OAT活性。综上所述,本研究中我们鉴定到了新的赖氨酸乙酰化修饰的蛋白质和去乙酰化酶CobB的底物,发现了赖氨酸乙酰化修饰和细菌中CobB蛋白的一个新功能,这对于原核生物中乙酰化修饰领域的研究具有十分重要的指导意义。

全文目录


摘要  9-10
Abstract  10-12
縮略语表  12-13
第一章 引言  13-41
  1 蛋白质的乙酰化研究进展  13-29
    1.1 N末端乙酰化修饰(N~α-乙酰化)  14-15
    1.2 赖氨酸乙酰化修饰(N~ε-乙酰化)  15-27
      1.2.1 真核生物中组蛋白的赖氨酸乙酰化  15-18
      1.2.2 真核生物中非组蛋白的赖氨酸乙酰化  18-19
      1.2.3 原核生物中的赖氨酸乙酰化  19-20
      1.2.4 赖氨酸乙酰转移酶/组蛋白乙酰转移酶  20-22
      1.2.5 赖氨酸去乙酰化酶/组蛋白去乙酰化酶  22-24
      1.2.6 Sir2类蛋白质去乙酰化酶  24-27
    1.3 蛋白质乙酰化修饰的检测  27-29
  2 NATs蛋白家族研究进展  29-37
    2.1 NATs蛋白家族的分布  30-32
    2.2 NATs蛋白的结构  32-34
    2.3 NATs蛋白的作用机制  34-36
    2.4 NATs蛋白的抑制剂  36-37
  3 蛋白质芯片研究进展  37-40
    3.1 蛋白质芯片的特点  37-38
    3.2 蛋白质芯片的种类  38
    3.3 蛋白质芯片的检测和应用  38-39
    3.4 结束语  39-40
  4 本研究的主要目的和意义  40-41
第二章 大肠杆菌CobB蛋白底物的筛选以及催化NhoA去乙酰化的研究  41-66
  1 材料与方法  42-50
    1.1 试验材料  42-45
      1.1.1 菌株  42
      1.1.2 培养基  42-43
      1.1.3 试剂与材料  43
      1.1.4 蛋白纯化缓冲液  43-44
      1.1.5 SDS-PAGE凝胶溶液  44
      1.1.6 Western Blot用缓冲液  44-45
      1.1.7 实验仪器  45
    1.2 实验方法  45-50
      1.2.1 蛋白质芯片的构建和CobB底物的筛选  45-46
      1.2.2 蛋白质的诱导表达  46-47
      1.2.3 蛋白质的纯化  47
      1.2.4 SDS-PAGE分析蛋白纯度及蛋白浓缩  47-48
      1.2.5 蛋白质浓度的测定及保存  48
      1.2.6 去乙酰化试验  48
      1.2.7 蛋白质的免疫印迹(Western blot)检测  48-49
      1.2.8 蛋白质的质谱鉴定  49-50
      1.2.9 自乙酰化试验  50
  2 结果与分析  50-64
    2.1 基于大肠杆菌蛋白质芯片的CobB底物的筛选  50-53
    2.2 大肠杆菌CobB蛋白与NhoA蛋白的表达与纯化  53-54
    2.3 大肠杆菌CobB催化NhoA的去乙酰化  54-55
    2.4 NhoA乙酰化与去乙酰化的质谱鉴定  55-62
    2.5 NhoA蛋白的自乙酰化分析  62-64
  3 讨论  64-66
第三章 乙酰化赖氨酸残基的突变对大肠杆菌NhoA酶活性的影响  66-94
  1 材料与方法  67-80
    1.1 试验材料  67-70
      1.1.1 菌株与质粒  67-68
      1.1.2 培养基  68-69
      1.1.3 试剂与材料  69
      1.1.4 蛋白纯化缓冲液  69
      1.1.5 SDS-PAGE凝胶溶液  69-70
      1.1.6 Western Blot用缓冲液  70
      1.1.7 ELISA用试剂  70
      1.1.8 试验仪器  70
    1.2 实验方法  70-80
      1.2.1 大肠杆菌质粒的提取  70
      1.2.2 大肠杆菌nhoA基因的定点突变及克隆  70-73
      1.2.3 大肠杆菌CaCl_2法感受态细胞的的制备及转化  73
      1.2.4 重组质粒的筛选、验证  73
      1.2.5 菌种的保存  73-74
      1.2.6 蛋白质的诱导表达及纯化  74
      1.2.7 SDS-PAGE分析蛋白纯度及蛋白浓缩  74
      1.2.8 蛋白质浓度的测定及保藏  74
      1.2.9 NhoA抗体的制备  74-75
      1.2.10 突变体蛋白的可溶性分析  75
      1.2.11 蛋白的免疫印迹(Western blot)检测  75
      1.2.12 NhoA的NAT活性测定  75
      1.2.13 大肠杆菌单基因敲除菌株的构建  75-80
      1.2.14 大肠杆菌基因组的提取  80
      1.2.15 诱变性试验  80
  2 结果与分析  80-90
    2.1 大肠杆菌nhoA野生型及突变体基因表达载体的构建  80-81
    2.2 重组质粒的筛选、验证  81-82
    2.3 大肠杆菌NhoA野生型及突变体蛋白可溶性分析  82-84
    2.4 大肠杆菌NhoA野生型及突变体蛋白乙酰化水平分析  84-85
    2.5 大肠杆菌NhoA野生型及突变体蛋白NAT活性的对比  85-86
    2.6 大肠杆菌NhoA野生型及突变体蛋白OAT活性的对比  86-90
      2.6.1 大肠杆菌nhoA基因敲除菌株的构建  86-88
      2.6.2 OAT活性的测定  88-90
  3 讨论  90-94
第四章 大肠杆菌CobB蛋白调节NhoA酶活性的研究  94-105
  1 材料与方法  94-98
    1.1 试验材料  94-96
      1.1.1 菌株和质粒  94-95
      1.1.2 培养基  95
      1.1.3 试剂与材料  95-96
      1.1.4 蛋白纯化缓冲液  96
      1.1.5 SDS-PAGE凝胶溶液  96
      1.1.6 Western Blot用缓冲液  96
      1.1.7 试验仪器  96
    1.2 实验方法  96-98
      1.2.1 蛋白质的诱导表达及纯化  96
      1.2.2 SDS-PAGE分析蛋白纯度及蛋白浓缩  96
      1.2.3 蛋白质浓度的测定及保藏  96
      1.2.4 蛋白的免疫印迹(Western blot)检测  96
      1.2.5 去乙酰化NhoA的NAT活性测定  96-97
      1.2.6 大肠杆菌单基因和双基因敲除菌株的构建  97
      1.2.7 大肠杆菌基因组的提取  97
      1.2.8 大肠杆菌体内NhoA乙酰化水平分析  97-98
      1.2.9 诱变性试验  98
  2 结果与分析  98-103
    2.1 去乙酰化对NhoA的NAT活性的影响  98-100
    2.2 大肠杆菌cobB敲除菌株及cobB与nhoA双敲除菌株的构建  100-101
    2.3 大肠杆菌体内NhoA乙酰化水平分析  101-102
    2.4 cobB基因敲除对NhoA的OAT活性的影响  102-103
  3 讨论  103-105
第五章 结论  105-106
参考文献  106-119
发表及待发表文章目录  119-120
致谢  120-121

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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