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甜橙果实发育与成熟过程中转录组变化及CsASR基因的功能分析

作　者: 余克琴
导　师: 邓秀新
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 甜橙 果实发育与成熟 转录组动力学 芽变 ASR基因 基因表达 超量表达 番茄 代谢物分析 类胡萝卜素 有机酸
分类号: S666.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


果实发育是一个高度协调的复杂生物学过程。作为非呼吸跃变型果实,柑橘果实发育和成熟过程的研究尽管已经逐步得到重视,但是对其分子调控机制的诠释还远远不够。果实成熟过程中形成的糖、酸和类胡萝卜素等物质是柑橘果实品质的重要组成部分,因此,研究柑橘果实成熟的分子以及类胡萝卜素等的积累机制对提高果实品质具有重要的理论价值。突变体‘红暗柳’甜橙果实在具有红肉性状的同时也表现为高蔗糖和低柠檬酸水平,为我们研究果实品质性状形成的分子机理提供了理想材料。本研究以突变体‘红暗柳’与野生型‘暗柳’为材料,采用表达谱测序技术分析了两者果实发育过程中转录组的差异,并重点描述了甜橙果实发育和成熟过程中的转录组动态变化,同时对一个候选基因CsASR的功能进行分析。主要研究结果如下：1利用Illumina测序平台对‘红暗柳’与‘暗柳’各4个发育时期(120DAF,150DAF,190DAF和220DAF)果实的果肉进行数字化表达谱测序。获得的平均标签数目约4.01M。将测序所得所有标签与参考数据库中的序列比对,发现占clean reads68.1%-76.2%共46,328-76,424条标签与参考数据库中已知功能或未知功能的序列具有同源性。以‘暗柳’为模型研究甜橙果实发育与成熟过程中的转录组变化。总共检测到18,829个基因至少在一个时期表达,其中8,825个基因在所有四个时期都有表达。利用Cluster软件对‘暗柳’甜橙果实发育和成熟过程中基因的表达模式进行聚类分析,所有的18,829个基因被聚成22类。聚类分析的结果也显示在‘暗柳’甜橙里检测到89.7%的基因表达量在果实发育和成熟的过程中发生了变化。比较突变体与野生型的基因表达模式发现两个品种中有20类表达模式是共同的。比较‘暗柳’甜橙不同发育时期转录组分别发现9,377个基因在花后120d和150d差异表达；7,886个基因在花后150d和190d差异表达；7,757个基因在花后190d和220d差异表达。生物学过程的GO注释分类结果显示,这些基因中36.7%被注释18条GO类型,且绝大部分基因被注释到代谢过程、细胞过程、建立定位、生物学调节、着色和逆境响应等。这些差异表达基因主要参与细胞壁代谢和软化、蔗糖代谢、三羧酸循环、类胡萝卜素代谢和逆境响应。比较不同发育时期‘暗柳’‘红暗柳’果实的转录组,结果显示分别有634、568、540和616个基因的表达在突变体和野生型花后120d、150d、190d和220d有显著差异(p<0.05和|log2Ratio|≥1)。许多差异表达基因编码逆境相关蛋白。对差异表达基因的数目进行分析发现在所有研究的这四个时期,突变体上调表达基因数目都少于该时期下调表达基因数目。去除冗余,在‘暗柳’和‘红暗柳’中差异表达的基因数目仅883个。对这些差异表达基因进行聚类分析,发现除花后150d外,与野生型相比超过一半的基因(492)在突变体所有的发育时期均上调表达。仅5个基因被发现在所有四个时期均差异表达。基于分子功能的GO注释分类分析显示883个差异表达基因大多数被注释到蛋白结合、水解酶活性、转移酶活性和转运子活性。GO富集分析显示类胡萝卜素代谢过程和辣椒红素/辣椒玉红素合成酶活性在突变体花后150d的果实显著富集。利用Real-Time PCR的方法对选择的22个差异表达基因在突变体和野生型果实发育和成熟过程中的表达进行验证,获得的基因表达模式与高通量测序所得的结果基本一致,两者的相关系数为0.8379。我们也测定了‘暗柳’和‘红暗柳’果实发育和成熟过程中果肉可溶性糖、有机酸、类胡萝卜素和H202的含量变化。在果实发育和成熟的后期可溶性糖的含量在‘暗柳’和‘红暗柳’中均显著增加。在整个果实发育和成熟过程中,‘红暗柳’果肉中的蔗糖含量均显著高于‘暗柳’,但是柠檬酸含量均显著低于‘暗柳’。总类胡萝卜素和番茄红素在‘红暗柳’中大量积累,但是在‘暗柳’中均维持比较低的含量。随着果实的发育和成熟,H202的含量下降,但是在花后120d,‘红暗柳’果肉中H2O2含量显著高于‘暗柳’。2转录组分析的结果以及前人的报道都显示ASR基因在‘红暗柳’和‘暗柳’中表达差异显著。根据获得的基因片段(FE659120)利用Tail-PCR扩增获得甜橙ASR基因的cDNA全长,命名为CsASR, GenBank登录号为HQ398364。进一步在甜橙中扩增获得DNA全长1213bp,含一个内含子。CsASR的cDNA全长为929bp,开放读码框为540bp,编码179个氨基酸。同源性分析表明甜橙CsASR推导的氨基酸序列与其他物种克隆的ASR基因有较高的同源性。保守区域分析表明CsASR与其他已知的ASR蛋白一样,它们的氨基酸序列都包含两个高度保守的区域。功能预测推测其可能参与转录调节,生长发育,转录和信号转导,概率分别为0.241,0.110,0.072和0.063。Southern杂交分析显示在大多数柑橘品种中,CsASR属于一个小的多基因家族。亚细胞定位分析发现CsASR与其他大多数转录因字一样定位在细胞核中。对CsASR基因在‘暗柳’和‘红暗柳’不同发育时期果实以及不同组织中的表达进行分析,结果发现CsASR基因主要在成熟组织,特别在成熟果实中表达。CsASR基因在‘暗柳’的果肉和果皮中的表达模式相同,但是在‘红暗柳’的果肉和果皮中CsASR的表达模式不同,除了在花后120d,整个发育时期CsASR基因在‘红暗柳’中的表达都比在‘暗柳’中的高。对CsASR基因在不同逆境条件下甜橙愈伤中的表达进行分析,结果显示高盐、低温、热和ABA处理条件下,CsASR基因均被显著诱导表达。用外源ABA处理‘暗柳’和‘红暗柳’转色前果实,结果显示ABA诱导‘红暗柳’果肉中可溶性糖和有机酸含量增加,而在‘暗柳’中,ABA处理导致可溶性糖和有机酸含量降低。但是对于类胡萝卜素我们只检测到花药黄质和α-胡萝卜素,尽管ABA处理后‘暗柳’果肉中类胡萝卜素的含量降低,但是在‘红暗柳’果肉中ABA处理前后类胡萝卜素的含量没有显著的变化。利用农杆菌介导遗传转化在番茄中超量表达CsASR基因,共获得11株抗性植株,T1代分离的阳性植株成熟果实显示与对照不同的红色。这些抗性植株与对照相比在形态学及果实的成熟期上并没有明显的差异。微分干涉显微观察的结果显示超量表达CsASR的番茄成熟果实的果皮细胞呈现红色,而对照为黄色。冷冻切片在明场下也显示两者的细胞结构有所不同,转基因番茄果实的细胞壁与对照相比增厚；进一步在荧光下观察发现转基因番茄果实的细胞壁呈现很强的蓝色荧光,即木质素含量较高,而对照表现不明显。HPLC分析结果显示紫黄质、p-胡萝卜素、番茄红素和八氢番茄红素的含量在CsASR超量表达番茄植株的成熟果实中都显著增加,而叶黄素的含量没有明显的差异。与对照相比,所有检测的类胡萝卜素代谢相关基因在CsASR超量表达番茄植株的成熟果实中都上调表达。GC-MS分析结果显示很多主要代谢产物的含量在转基因番茄果实中均发生了改变。几乎所有检测到的糖类代谢物及包括三羧酸循环代谢中间产物在内的所有检测到的有机酸的含量在CsASR超量表达的番茄果实中都低于对照。很多氨基酸的含量也发生了变化。对CsASR超量表达的番茄果实中主要代谢相关基因的表达分析结果发现主要代谢产物的变化与相应基因表达是吻合的。LC-MS技术检测了转基因番茄果实中ABA的含量,结果发现CsASR超量表达的番茄果实中ABA的含量显著低于对照。表达谱测序结果显示,与对照相比总共有401个基因在CsASR超量表达番茄果实中显著差异表达(FDR<0.001and|log2Ratio|≥1),其中180个基因上调,221个基因下调表达。这些差异表达基因包括9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因、Ring-finger蛋白以及含有APETALA2(AP2)结构域的蛋白等。利用KEGG数据库对RNA-seq的结果进行分析,结果发现主要代谢过程、次生代谢过程、植物激素信号传导和类胡萝卜素生物合成等代谢途径在CsASR超量表达番茄果实中发生显著变化。

全文目录


摘要  8-12
Abstract  12-16
缩略词表  16-18
第一章 课题提出与研究进展  18-34
  1 课题的提出  18-19
  2 柑橘芽变的发掘与应用  19-20
    2.1 芽变的概念与特点  19
    2.2 芽变的应用  19
    2.3 芽变的研究进展  19-20
  3 柑橘红肉突变体的研究进展  20-23
    3.1 柑橘红色突变的类型  20
    3.2 柑橘红色突变的研究进展  20-23
      3.2.1 生理水平  21
      3.2.2 分子标记水平  21
      3.2.3 转录水平  21-22
      3.2.4 转录后水平  22
      3.2.5 蛋白水平  22-23
  4 柑橘果实发育研究进展  23-25
    4.1 柑橘果实发育的特点  23-24
    4.2 柑橘果实发育的分子调节机制  24-25
  5 转录组测序技术的发展与应用  25-29
    5.1 转录组测序技术的发展  25-26
    5.2 转录组测序技术在植物研究中的应用  26-29
      5.2.1 发现新基因  26-27
      5.2.2 挖掘分子标记和SNP  27
      5.2.3 研究生物学问题  27-28
      5.2.4 sRNA的鉴定及功能研究  28-29
  6 ASR(Abscisic acid,stress and ripening)基因的研究进展  29-32
    6.1 ASR基因在植物中的分离  29-30
    6.2 ASR基因的结构  30
    6.3 ASR基因在植物响应逆境应答方面的研究进展  30-31
    6.4 ASR基因调节植物果实成熟及品质形成的研究进展  31-32
  7 本研究的目的和内容  32-34
第二章 甜橙果实转录组分析  34-70
  1 引言  34-36
  2 材料与方法  36-42
    2.1 实验材料  36
      2.1.1 植物材料  36
      2.1.2 主要生化试剂及仪器设备  36
    2.2 实验方法  36-42
      2.2.1 样品制备  36-37
      2.2.2 转录组测序  37
      2.2.3 转录组测序分析  37-38
        2.2.3.1 去除杂质数据  37
        2.2.3.2 表达量分布、测序饱和度及实验重复性分析  37
        2.2.3.3 标签的基因注释、标准化  37-38
        2.2.3.4 差异表达基因的筛选  38
        2.2.3.5 差异表达基因表达模式聚类及GO、Pathway显著性富集分析  38
      2.2.4 可溶性糖、有机酸及H_2O_2含量的测定  38-40
        2.2.4.1 可溶性糖和有机酸的提取和测定  38-39
        2.2.4.2 H_2O_2的提取和测定  39-40
      2.2.5 Real-Time PCR分析基因表达  40-42
  3 结果与分析  42-66
    3.1 测序产量统计  42-45
    3.3 比对统计  45
    3.4 果实发育与成熟过程中转录组变化  45-51
    3.5 果实发育与成熟过程中差异表达基因  51-55
    3.6 ‘暗柳’‘红暗柳’果实发育过程中转录组差异  55-62
    3.7 Real-Time PCR验证基因表达  62
    3.8 ‘暗柳’‘红暗柳’果实发育过程中糖酸,类胡萝卜素及H_2O_2含量变化  62-66
  4 讨论  66-70
    4.1 甜橙果实发育的转录组动力学变化  66-67
    4.2 ‘红暗柳’甜橙突变性状形成的可能分子机制  67-70
第三章 候选基因CsASR的功能分析  70-126
  1 引言  70-71
  2 材料与方法  71-92
    2.1 实验材料  71-72
      2.1.1 植物材料  71-72
      2.1.2 菌株、质粒和载体  72
      2.1.3 主要生化试剂及仪器设备  72
    2.2 实验方法  72-92
      2.2.1 CsASR基因的克隆  72-77
      2.2.2 CsASR基因功能特性研究  77-84
        2.2.2.1 CsASR基因生物信息学分析  77
        2.2.2.2 CsASR基因拷贝数分析  77-79
        2.2.2.3 CsASR亚细胞定位分析  79-81
        2.2.2.4 CsASR基因表达分析  81-82
        2.2.2.5 ABA处理转色前果实  82
        2.2.2.6 原核表达载体pET-CsASR的构建  82-83
        2.2.2.7 pET-CsASR诱导表达及SDS-PAGE检测  83
        2.2.2.8 植物表达载体pBI-CsASR的构建  83-84
      2.2.3 CsASR基因对番茄的遗传转化  84-89
        2.2.3.1 农杆菌介导CsASR基因转化番茄  84-85
        2.2.3.2 CsASR转基因番茄植株的分子检测  85-86
        2.2.3.3 CsASR基因在转化番茄再生植株中的表达分析  86
        2.2.3.4 CsASR转基因番茄果实的显微观察  86-87
        2.2.3.5 CsASR转基因番茄果实主要代谢物含量分析  87
        2.2.3.6 CsASR转基因番茄果实类胡萝卜素含量分析  87-88
        2.2.3.7 CsASR转基因番茄果实ABA含量分析  88-89
        2.2.3.8 CsASR转基因番茄果实主要代谢相关基因的表达分析  89
        2.2.3.9 CsASR转基因番茄果实类胡萝卜素生物合成基因的表达分析  89
      2.2.4 CsASR转基因番茄果实的转录组测序分析  89-92
        2.2.4.1 标签的注释及标准化  89-91
        2.2.4.2 差异表达基因的筛选及功能注释  91-92
  3 结果与分析  92-120
    3.1 CsASR基因序列及进化分析  92-95
    3.2 CsASR基因编码蛋白的结构分析与功能预测  95-96
    3.3 CsASR基因拷贝数分析  96-97
    3.4 CsASR亚细胞定位  97-98
    3.5 CsASR基因表达分析  98-100
      3.5.1 时空表达分析  98-99
      3.5.2 逆境诱导表达分析  99-100
    3.6 ABA处理转色前甜橙果实中糖酸及类胡萝卜素含量分析  100-103
    3.7 CsASR基因重组蛋白表达分析  103-104
    3.8 CsASR基因植物遗传转化载体的构建  104-106
    3.9 CsASR基因对番茄遗传转化  106-120
      3.9.1 CsASR转基因番茄植株的获得  106-107
      3.9.2 CsASR转基因番茄植株的分子鉴定  107-109
      3.9.3 CsASR转基因番茄果实显微观察  109-111
      3.9.4 CsASR转基因番茄果实类胡萝卜素含量及代谢相关基因表达分析  111-113
      3.9.5 CsASR转基因番茄果实主要代谢物含量分析  113-114
      3.9.6 CsASR转基因番茄果实主要代谢相关基因表达的变化  114-117
      3.9.7 CsASR转基因番茄果实转录组的变化  117-120
  4 讨论  120-123
    4.1 CsASR基因的基本特征  120-121
    4.2 CsASR基因能被ABA、逆境和成熟诱导  121-122
    4.3 CsASR基因可能影响果实中的主要代谢  122
    4.4 CsASR基因可能作为转录调节复合体的一部分调节果实中类胡萝卜素的积累  122-123
  5 后续研究的设想  123-126
参考文献  126-141
附录 攻读博士期间发表的论文  141-142
致谢  142

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类 > 橙
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