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Cu²⁺胁迫对黑曲霉生长和产多聚半乳糖醛酸酶的影响

作　者: 李彬
导　师: 孙中涛
学　校: 山东农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 黑曲霉铜胁迫生长多聚半乳糖醛酸酶
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

铜作为自然界普遍使用的重金属之一，其污染已经成为目前最为严重的环境污染之一。Cu²⁺污染主要来源于工业农业废水、城市生活废水、铜锌矿石采矿废水的排放、灌溉过程以及硫酸铜杀虫剂等农药的大量施用，释放到大气和土壤环境中对人类和动植物产生了危害。本文通过研究产多聚半乳糖醛酸酶（PG）的工业菌种黑曲霉菌株PQ在不同Cu²⁺浓度下的菌株生长和发酵的影响来反映菌株对Cu²⁺的胁迫反应。通过生长皿抑制法得到黑曲霉PQ在Cu²⁺胁迫下的正常生长临界浓度（MTC）为0.05mmol/L，超过此浓度，则表现出生长抑制作用，无菌落生长最低浓度（MIC）为3mmol/L，超过此浓度菌体不再生长。通过Cu²⁺胁迫对黑曲霉孢子萌发率、菌落生长，生物量积累，胞内可溶性蛋白的含量以及液态发酵过程中还原糖、总糖和蛋白含量的变化，结果表明在0.01mmol/LCu²⁺浓度环境下对黑曲霉的生长和产酶影响不显著，相反，甚至对其生长和产酶具有一定的促进作用，但是在0.5和1.0mmol/L Cu²⁺浓度下，黑曲霉的生长和产酶均受到明显的抑制。另外，研究得到在0.01mmol/L Cu²⁺浓度下黑曲霉胞内抗氧化酶SOD和CAT均与对照无显著的差异，但是在0.5和1.0mmol/L Cu²⁺浓度下黑曲霉胞内SOD和CAT与对照相比分别显著提高和降低，结果表明黑曲霉PQ对Cu²⁺的抗性和耐性与黑曲霉菌株抗氧化防御系统的作用有关。数据为真菌抗氧化系统参与的生物修复的理论创新提供了有价值的信息，并且在工业生产PG的发酵工艺中对于合理控制Cu²⁺浓度维持正常的PG酶活提供了理论依据。根据生长皿抑制法得到的MTC，实验向固态发酵原料苹果渣和棉粕中添加硫酸铜，使发酵基质中的Cu²⁺含量为2.56mg/kg来模拟低浓度的铜污染，以不加硫酸铜的实验作对照，来考虑低浓度铜污染后的培养基是否对黑曲霉固态发酵产生影响，并对上述铜污染的培养基通过单因子和正交试验进行了优化，得到最适培养基为苹果渣10g、棉粕10g、（NH₄）₂SO₄0.2g、K₂HPO₄0.06g、初始含水量60%；最适发酵条件为装料量为20g干料/250ml三角瓶，30C恒温培养48h，在这此最佳条件下，铜污染组和无污染组产多聚半乳糖醛酸酶酶活力均可达37万U/g。结果表明与对照相比黑曲霉在铜污染的固态培养基上产PG能力没有受到显著影响。但是根据固态发酵过程中还原糖和总糖的在前期高于对照组的含量的这一现象，反映出低浓度的Cu²⁺对黑曲霉固态培养上生长的初期具有一定的影响，但是这种影响很快就会消失。除此之外，本文还对在铜污染的培养基中固态发酵所得PG粗酶液和无污染的对照组发酵所得粗酶液进行了酶学性质的研究，通过对最适pH、最适温度、pH稳定性、热稳定性和酶促反应动力学的研究，表明铜污染的PG粗酶液与对照组粗酶液在酶学性质上无显著差异。两种PG粗酶液的最适温度均为45C，在60C以下稳定性较好，PG的最适pH为5，在酸性环境中稳定性较好。研究也证明了以废弃苹果渣代替麸皮作为黑曲霉PQ固态发酵生产PG的主要原料是可行的，可大大地降低原料成本，同时还能够一定程度上解决苹果渣的再利用问题。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-27
  1.1 果胶质与多聚半乳糖醛酸酶概述  13-21
    1.1.1 果胶质概述  13-14
    1.1.2 多聚半乳糖醛酸酶概述  14
    1.1.3 产多聚半乳糖醛酸酶的菌株  14-15
    1.1.4 真菌多聚半乳糖醛酸酶的分子生物学研究进展  15-16
      1.1.4.1 真菌多聚半乳糖醛酸酶基因及其特征  15
      1.1.4.2 真菌多聚半乳糖醛酸酶基因的表达调控  15
      1.1.4.3 真菌多聚半乳糖醛酸酶基因分子进化  15-16
      1.1.4.4 真菌多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白  16
    1.1.5 果胶酶的应用  16-18
      1.1.5.1 在棉纺织业和麻类脱胶中的应用  16
      1.1.5.2 在饲料行业中的应用  16-17
      1.1.5.3 在污水处理中的作用  17
      1.1.5.4 在食品工业中的作用  17
      1.1.5.5 在医疗上的应用  17
      1.1.5.6 在植物病毒纯化中的应用  17-18
    1.1.6 黑曲霉概述  18
    1.1.7 黑曲霉发酵多聚半乳糖醛酸酶的研究现状  18-21
      1.1.7.1 黑曲霉发酵多聚半乳糖醛酸酶的培养基原料  18
      1.1.7.2 黑曲霉发酵多聚半乳糖醛酸酶的菌种的筛选和诱变方法  18-19
      1.1.7.3 黑曲霉发酵多聚半乳糖醛酸酶生产方式  19-20
      1.1.7.4 黑曲霉发酵多聚半乳糖醛酸酶的培养基优化方法  20-21
  1.2 Cu~(2+)胁迫  21-25
    1.2.1 环境中的 Cu~(2+)  21
    1.2.2 Cu~(2+)的化学特性  21-22
    1.2.3 Cu~(2+)对微生物的影响  22
    1.2.4 Cu~(2+)对动植物的影响  22
    1.2.5 植物对 Cu~(2+)的抗性机理  22-23
    1.2.6 微生物对 Cu~(2+)抗性机理  23-24
      1.2.6.1 细菌对 Cu~(2+)的抗性机理  23-24
      1.2.6.2 真菌对 Cu~(2+)抗性机理  24
      1.2.6.3 土壤动物对 Cu~(2+)抗性机理  24
    1.2.7 Cu~(2+)的生物吸附  24-25
  1.3 研究的目的和意义以及主要内容  25-27
    1.3.1 研究的目的和意义  25-26
    1.3.2 主要的研究内容  26-27
2 材料与方法  27-38
  2.1 实验材料  27-29
    2.1.1 菌种  27
    2.1.2 试剂及配制  27-28
    2.1.3 仪器和设备  28-29
    2.1.4 培养基  29
  2.2 实验方法  29-38
    2.2.1 孢子菌悬液的制备  29
    2.2.2 培养方法  29
    2.2.3 生长抑制皿法确定黑曲霉对 Cu~(2+)的抗性和耐性  29-30
    2.2.4 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉菌株孢子萌发率的测定  30
    2.2.5 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉菌株菌落生长直径的测定  30
    2.2.6 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉菌丝生长量的测定  30
    2.2.7 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉胞内可溶性蛋白含量及抗氧化酶 SOD 和 CAT 活性的测定  30-32
      2.2.7.1 细胞抽提液的制备  30-31
      2.2.7.2 可溶性蛋白的测定  31
      2.2.7.3 SOD 的测定  31-32
      2.2.7.4 CAT 的测定  32
    2.2.8 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉液态发酵参数的变化  32-34
      2.2.8.1 发酵液中还原糖的测定  32-33
      2.2.8.2 发酵液中总糖的测定  33
      2.2.8.3 发酵液中可溶性蛋白含量的测定  33
      2.2.8.4 发酵液中 PG 酶活性的测定  33-34
    2.2.9 以铜污染的苹果渣和棉粕为材料的黑曲霉固态发酵产 PG 的工艺优化  34-36
      2.2.9.1 苹果渣和棉粕的铜污染处理  34
      2.2.9.2 铜污染苹果渣和棉粕的培养基配比对产 PG 的影响  34
      2.2.9.3 无机氮源对产 PG 的影响  34
      2.2.9.4 K_2HPO_4在发酵过程中对产 PG 的影响  34
      2.2.9.5 CaCl_2在发酵过程中对产 PG 的影响  34-35
      2.2.9.6 铜污染的培养基优化正交试验设计  35
      2.2.9.7 培养温度对产 PG 的影响  35
      2.2.9.8 装料量对产 PG 的影响  35
      2.2.9.9 发酵过程中糖的添加对产 PG 的影响  35
      2.2.9.10 固态发酵过程中黑曲霉发酵产 PG 酶活力及一些生长参数  35-36
    2.2.10 PG 粗酶液的酶学性质的研究  36-38
      2.2.10.1 粗酶液的制备  36
      2.2.10.2 PG 的最适作用温度  36-37
      2.2.10.3 PG 的最适 pH  37
      2.2.10.4 PG 的热稳定性  37
      2.2.10.5 PG 的 pH 稳定性  37-38
3 结果与分析  38-59
  3.1 黑曲霉菌株对 Cu~(2+)的 MIC 和 MTC 的确定  38-39
  3.2 Cu~(2+)胁迫对黑曲霉生长的影响  39-42
    3.2.1 Cu~(2+)胁迫对黑曲霉孢子萌发率的影响  39
    3.2.2 Cu~(2+)胁迫对黑曲霉菌落生长的影响  39-40
    3.2.3 Cu~(2+)胁迫对黑曲霉菌丝生长量的影响  40-41
    3.2.4 Cu~(2+)胁迫下胞内可溶性蛋白的影响  41-42
  3.3 Cu~(2+)胁迫对黑曲霉胞内抗氧化酶的 SOD 和 CAT 活性的影响  42-44
    3.3.1 Cu~(2+)胁迫对黑曲霉胞内 SOD 活性的影响  42
    3.3.2 Cu~(2+)胁迫对黑曲霉胞内 CAT 活性的影响  42-44
  3.4 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉液态发酵参数的变化  44-48
    3.4.1 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉液态发酵基质中总糖含量的变化  44-45
    3.4.2 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉发酵液中还原糖的变化  45-46
    3.4.3 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉发酵液中可溶性蛋白的变化  46
    3.4.4 Cu~(2+)胁迫下黑曲霉液态发酵产多聚半乳糖醛酸酶酶活的变化  46-48
  3.5 铜污染的苹果渣和棉粕为材料的黑曲霉 PQ 固态发酵的工艺优化  48-55
    3.5.1 苹果渣和棉粕配比对产 PG 的影响  48
    3.5.2 无机氮源对黑曲霉利用含铜培养基产 PG 的影响  48-49
    3.5.3 K_2HPO_4对黑曲霉利用含铜培养基产 PG 的影响  49-50
    3.5.4 CaCl_2对黑曲霉利用含铜培养基产 PG 的影响  50
    3.5.5 培养基优化正交试验结果  50-51
    3.5.6 培养温度对产 PG 的影响  51
    3.5.7 装料量对产 PG 的影响  51-52
    3.5.8 葡萄糖的添加对 PG 的影响  52-53
    3.5.9 固态发酵过程中可溶性糖和总糖含量的变化  53
    3.5.10 固态发酵过程中粗蛋白和精蛋白含量的变化  53-54
    3.5.11 发酵时间对黑曲霉 PQ 在铜污染的培养基上生长与产 PG 的影响  54-55
  3.6 多聚半乳糖醛酸酶酶学性质  55-59
    3.6.1 粗酶液的最适作用 pH 值  55
    3.6.2 粗酶液的 pH 稳定性  55-57
    3.6.3 粗酶液的最适温度  57
    3.6.4 粗酶液的热稳定性  57-58
    3.6.5 粗酶液的米氏常数（K_m）和最大反应速率（V_(max)）  58-59
4 讨论  59-61
5 结论  61-62
参考文献  62-69
致谢  69-70
攻读学位期间发表论文情况  70

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