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国产水痘减毒活疫苗株即刻早期基因ORF62特征的分析

作　者: 吴宁俊
导　师: 王官清
学　校: 厦门大学
专　业: 微生物学
关键词: 水痘-带状疱疹病毒 即刻早期基因62 启动子活力 反式激活力
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


目的：通过比较两株国产水痘减毒活疫苗株(vOka)与其父系株(pOka)的即刻早期基因ORF62启动子区序列、启动子的启动活力和启动子区转录因子结合基序的差异,以及ORF62编码区序列及其编码即刻早期蛋白(IE62)反式激活力的差异,探讨vOka株ORF62突变在其减毒机制中的可能作用。方法：1、应用分子克隆技术克隆构建长春百克生物科技股份公司vOka-BK株、上海生物制品研究所vOka-SH株、葛兰素-史克公司vOka_GSK株(对照)及其父系pOka株ORF62启动子的启动子-报告子质粒,以及ORF62编码区的表达质粒。2、应用基因测序技术测定三株vOka与其父系株pOka的ORF62启动子区和编码区序列并分析其差异。3、应用转录因子结合基序(motif)扫描软件TFSEARCH分析三株vOka与其父系株pOka的ORF62启动子区转录因子结合基序并比较其差异。4、应用基因转染瞬时表达技术分析三株vOka与其父系株pOka ORF62启动子的启动活力以及ORF62编码蛋白IE62对即刻早期(IE)基因ORF4、早期(E)基因ORF28和晚期(L)基因ORF67启动子反式激活力的差异。结果：1、与父系株pOka比较,三株vOka的ORF62启动子区110,050位点存在一致性T缺失突变。2、三株vOka ORF62启动子区110,050位点T缺失突变未导致启动子区转录因子结合基序改变。3、在pOka株或vOka株IE62激活下,三株vOka ORF62启动子的启动活力均显著低于其父系株pOka。4、三株vOka ORF62编码区存在一致性106,262位点T→C置换突变、107,136位点T→C置换突变、107,252位点T→C置换突变,这些碱基置换突变各新增一个限制性内切酶Sma Ⅰ、Nae Ⅰ和BssH Ⅱ的酶切新位点。5、除vOka-SH株IE62在CV-1细胞中对即刻早期基因ORF4启动子的反式激活力显著低于pOka株外,三株vOka IE62在CV-1和MeWo细胞中对即刻早期基因ORF4、早期基因ORF28和晚期基因ORF67启动子的反式激活力均显著高于pOka株。结论:1、三株vOka ORF62启动子区110,050位点存在的T缺失突变可能是其启动子启动活力降低以及IE62反式激活力改变的原因之一。2、三株vOka ORF62启动子区110,050位点T缺失突变区转录因子Spl结合基序并非水痘减毒活疫苗减毒的必需因素。3、vOka株和pOka株ORF62编码IE62均可弱激活其自身启动子。4、vOka株与pOka株ORF62启动子的启动活力和ORF62编码IE62的反式激活力差异与转染所用细胞类型的关系不大。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章 前言  12-18
  1.1 水痘-带状疱疹病毒基因组DNA的特征  12
  1.2 水痘减毒活疫苗的研制  12-13
  1.3 水痘减毒活疫苗的安全性和有效性  13-14
  1.4 水痘减毒活疫苗减毒机制的研究  14-17
  1.5 国产水痘减毒活疫苗ORF62特征研究的现状  17-18
第二章 实验材料  18-22
  2.1 细胞  18
  2.2 病毒基因组  18
  2.3 主要试剂  18-19
  2.4 主要仪器  19
  2.5 主要溶液配制  19-20
  2.6 主要实验器具的处理  20-22
第三章 实验方法  22-34
  3.1 细胞培养和传代  22
  3.2 重组质粒克隆构建  22-32
    3.2.1 ORF62启动子-报告子质粒  22-32
    3.2.2 ORF62表达质粒  32
  3.3 ORF62启动子区和编码区序列测定  32
  3.4 ORF62启动子区转录因子结合基序比较  32-33
  3.5 基因转染瞬时表达  33
  3.6 统计分析  33-34
第四章 实验结果  34-39
  4.1 各vOka株与pOka株ORF62启动子区序列比较  34-35
  4.2 各vOka株与pOka株ORF62启动子区转录因子结合基序比较  35-36
  4.3 各vOka株与pOka株ORF62启动子的启动活力比较  36-37
  4.4 各vOka株与pOka株ORF62编码区序列比较  37
  4.5 各vOka株与pOka株ORF62编码IE62的反式激活力比较  37-39
第五章 讨论  39-42
第六章 结论  42-43
附录  43-44
参考文献  44-47
致谢  47-48
文献综述  48-58
  参考文献  55-58

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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