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Resilin-R5融合蛋白表达纯化及其材料性能研究

作　者: 毛争争
导　师: 刘子铎
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Resilin R5肽原核表达蛋白纯化壳聚糖复合生物材料
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

Resilin-R5融合蛋白是将天然超强弹性蛋白Resilin和硅沉积肽R5线性连接形成的人工嵌段高分子。其中,Resilin是一类具备超强弹性的生物蛋白,在一些昆虫外骨骼,飞行系统,发声系统等有着广泛的分布,交联后的Resilin所具备的超高弹性以及变性复原能力要远远高于普通橡胶,在材料学、医学和组织工程等领域具备很高的潜在应用价值。R5肽来自硅藻(Cylindrotheca fusiformis)细胞壁中silaffin前体多肽C端的由19个氨基酸构成的功能单位,能够诱导和调节硅藻中二氧化硅的沉积作用。其所展示的体外二氧化硅沉积性能,能获得具有不同形态学特征的拱形结构和细长纤维结构,暗示了其在纳米材料等领域的潜在应用价值。本论文为了获得兼具“高弹性”和“硅沉积”性能的新型功能生物材料,将具有高弹性的Resilin蛋白与具有硅沉积作用的R5肽进行了融合,研究了其在大肠杆菌中的表达,及纯化方法。首先,将果蝇弹性蛋白基因CG15920序列与硅藻R5肽基因序列进行拼接,经过稀有密码子优化后合成重组基因resilin-r5。然后将其插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS获得表达菌株,并通过IPTG进行诱导表达。同时将resilin-r5插入到载体pUC57后转化E.coliAclpX, E. coli BW25113, E.coli DH5a等大肠杆菌菌株比较不同菌株的表达差异,以期获取更高的目标蛋白表达量。最后以盐析加热法和Ni离子柱亲和层析法纯化带组氨酸标签的重组融合蛋白。最终实现Resilin-R5融合蛋白的高效表达,产量达到120mg/L发酵液。并采用6×His标签Western blot和蛋白质C端测序,证实所获得融合蛋白为全长目标蛋白Resilin-R5。进一步将Resilin-R5与天然阳性多糖-壳聚糖按一定比例共混,制备了系列Resilin-R5/壳聚糖共混复合膜材料。对复合膜材料的溶胀性能、透气性、吸水率、保水率、光催化交联性能、二氧化硅沉积性能和力学性能进行了测试；并采用傅立叶变换红外光谱分析、差示扫描量热分析和显微观察对复合膜内部基团间相互作用、共混性能和膜形貌进行了测试分析。结果表明,伴随Resilin-R5比例升高,复合膜溶胀比呈逐步下降趋势,最低溶胀比约为纯壳聚糖膜的50%；当Resilin-R5比例分别为7%和33%时复合膜透气性较高,分别达到403g/m2·24h和392g/m2·24h,均显著高于纯壳聚糖膜；复合膜的吸水率和保水率伴随Resilin-R5比例升高呈升高趋势,最高分别达到264%和231%,均显著高于纯壳聚糖膜；复合膜形貌表现为多微球聚集膜材料,经光催化后能够形成紫外下发射蓝色荧光的交联体,并能催化硅酸甲酯水解在膜表面或内部形成颗粒状沉积物；当Resilin-R5比例为13%时,复合膜具有最高拉伸长度和最高拉断强度,分别为41.6%和32.1MPa,显著高于纯壳聚糖；傅立叶变换红外光谱和差示扫描量热分析结果表明,Resilin-R5与壳聚糖间存在相互作用,且当Resilin-R5比例低于20%时,Resilin-R5与壳聚糖间具有良好的共混性能。综上所述,本文设计合成了resilin-r5融合基因,并在大肠杆菌中实现了高效表达和纯化,创制了Resilin-R5这一新型蛋白质类生物材料；Resilin-R5/壳聚糖复合膜具有优良的材料学性能,在医用敷料和缝合线方面具有良好的应用潜力。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-11
1 前言  11-24
  1.1 Resilin概述  11-16
    1.1.1 Resilin的发现  11
    1.1.2 Resilin的生物合成  11-13
    1.1.3 Resilin的特性  13
    1.1.4 重组Resilin蛋白研究进展  13-14
    1.1.5 Resilin相关融合蛋白的研究及应用  14-16
  1.2 R5肽概述  16-19
    1.2.1 silaffins简介  16-18
    1.2.2 R5肽在纳米颗粒形成中的作用  18
    1.2.3 R5肽相关融合蛋白的研究  18-19
  1.3 壳聚糖概述  19-22
    1.3.1 壳聚糖简介  19-21
    1.3.2 壳聚糖在膜材料中的应用  21-22
  1.4 高分子共混材料的表征方法  22-23
  1.5 本论文研究目的及意义  23-24
2 材料和方法  24-46
  2.1 材料  24-30
    2.1.1 菌株与质粒  24-25
    2.1.2 药品  25
    2.1.3 培养基  25
    2.1.4 试剂  25-29
    2.1.5 仪器设备  29-30
  2.2 Resilin-R5的表达和纯化  30-41
    2.2.1 resilin-r5基因优化合成  30-31
    2.2.2 resilin-r5基因表达载体构建  31-34
    2.2.3 重组表达载体转化  34-36
    2.2.4 液体培养基发酵  36-37
    2.2.5 固体培养基培养  37
    2.2.6 蛋白提取  37-38
    2.2.7 基于Resilin蛋白热稳定性的盐析加热法纯化目的蛋白  38
    2.2.8 基于组氨酸标签亲和层析纯化目的蛋白  38-39
    2.2.9 SDS-PAGE电泳  39-40
    2.2.10 融合蛋白的Western-Blot检测  40-41
    2.2.11 蛋白质C端测序  41
  2.3 Resilin-R5融合蛋白与壳聚糖复合膜制备及相关材料学性能研究  41-46
    2.3.1 Resilin-R5与壳聚糖复合膜材料制备  41-42
    2.3.2 Resilin-R5融合蛋白和复合膜光化学交联  42
    2.3.3 Resilin-R5融合蛋白和复合膜二氧化硅沉积  42-43
    2.3.4 复合膜材料溶胀性能测试  43
    2.3.5 复合膜材料透气性测试  43
    2.3.6 复合膜材料吸水率和保水率测试  43
    2.3.7 复合膜材料力学性能测试  43-44
    2.3.8 复合膜材料红外吸收光谱分析  44-45
    2.3.9 复合膜材料差示扫描量热(DSC)分析  45-46
3 结果与分析  46-60
  3.1 Resilin-R5融合蛋白的表达和纯化  46-52
    3.1.1 resilin-r5基因优化  46
    3.1.2 resilin-r5基因表达载体构建  46-48
    3.1.3 不同菌株蛋白表达比较  48-49
    3.1.4 盐析加热法纯化目的蛋白  49
    3.1.5 亲和层析纯化目的蛋白  49-50
    3.1.6 目的蛋白的Western-Blot检测  50-51
    3.1.7 目的蛋白C端测序  51-52
  3.2 Resilin-R5与壳聚糖复合膜制备及相关材料学性能研究  52-60
    3.2.1 Resilin-R5与壳聚糖复合膜外观  52
    3.2.2 Resilin-R5融合蛋白和复合膜光化学交联  52-53
    3.2.3 Resilin-R5融合蛋白和复合膜材料二氧化硅沉积  53-54
    3.2.4 复合膜材料溶胀性分析  54-55
    3.2.5 复合膜材料透气性分析  55
    3.2.6 复合膜材料吸水率和保水率分析  55-56
    3.2.7 复合膜材料力学性能分析  56-58
    3.2.8 复合膜材料红外吸收光谱分析  58-59
    3.2.9 复合膜材料差示扫描量热(DSC)分析  59-60
4 讨论  60-62
参考文献  62-67
附录  67-68
致谢  68

Resilin-R5融合蛋白表达纯化及其材料性能研究

内容摘要

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