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细胞内表达掌叶半夏凝集素基因抗肿瘤的机制研究

作　者: 路巧然
导　师: 刘新垣；李恭楚
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 掌叶半夏凝集素肿瘤 Survivin启动子蛋白功能域domain pulldown
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

恶性肿瘤目前已经超越心血管疾病,成为危害人类健康和生命的重大杀手,随着每年肿瘤患者的发病率和死亡率的急剧增加,外用中医药治疗肿瘤已经无法达到治疗的目的,肿瘤传统疗法的发展已经举步维艰,人类迫切需要寻找更加有效安全的治疗理念和方法来达到治标治本的目的。按照刘新垣院士所提出的靶向基因-病毒治疗策略,通过病毒基因疗法这个新概念,利用病毒载体携带一个或多个肿瘤治疗基因来实现对肿瘤细胞的有效杀伤,从而为肿瘤治疗的前景带来了新的曙光与希望。另外,由特异性启动子携带目的基因的病毒对肿瘤细胞的杀伤效果更强一筹。因此在构建病毒载体的同时,选择一个好的治疗基因尤其重要。掌叶半夏凝集素(Pinellia Pedatisecta Agglutinin, PPA)是存在于中草药掌叶半夏中的单子叶甘露糖型植物凝集素,能特异性识别并结合甘露糖。其特有的糖结合特性可能为分析各种肿瘤细胞表面糖链结构变化及对肿瘤恶化、迁移及预后等方面的研究提供有用的工具。目前关于PPA抗肿瘤的研究都是作为外用药物,对PPA的药理作用机制也未进行深入探讨。我们将PPA基因导入肿瘤细胞使其表达,并对其致死机制作了研究。首先,为了研究PPA蛋白的功能结构域,我们用构建的携带PPA基因片段的真核表达载体转染细胞,结果显示除A1区段外,其余区段均起初以散点的形式分布在细胞,而后聚集于细胞某一区域,并且与细胞核染料Hoechst染色区重叠,此结果显示融合蛋白在细胞核区的分布。随着时间的推移当48h后,细胞核与完整的核作对比出现弥散、解聚的状态。结果提示蛋白可进入细胞核并进一步与DNA结合引发细胞核解体。实验结果为今后对PPA的进一步改造及应用于肿瘤基因治疗提供了一定的依据。另外,我们构建真核表达质粒载体pCDNA3/flag-PPA,转染肿瘤细胞,用Western blot检测显示了PPA在细胞内的表达;接着在细胞信号通路机制方面检测PPA如何引起细胞死亡;同时我们利用pulldown和质谱技术寻找并鉴定与PPA相互作用的蛋白质,研究PPA是否与其他蛋白质共同作用来诱导肿瘤细胞的死亡,以及PPA蛋白作用的靶点;最后我们还构建了一个由survivin启动子控制PPA基因表达的复制缺陷性腺病毒,通过体外MTT实验证实了目的病毒能够特异性的杀伤肿瘤细胞,抑瘤效果非常显著;结晶紫实验显示了该重组病毒对癌细胞的杀伤力以及对正常细胞的安全性,为PPA成为治疗基因的可行性奠定了基础。

全文目录

中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略词表  12-15
第一章：掌叶半夏凝集素（PPA）治疗肿瘤的前景  15-24
  1.1 植物凝集素的概述  15
  1.2 植物凝集素对医疗行业的贡献  15-16
  1.3 掌叶半夏凝集素的现状及概况  16
  1.4 掌叶半夏凝集素的抗肿瘤研究  16-17
  1.5 现阶段肿瘤的研究进展  17-22
    1.5.1 肿瘤的基因治疗  17-19
    1.5.2 survivin 与肿瘤靶向  19-21
    1.5.3 肿瘤治疗基因PPA 在肿瘤治疗中的应用  21-22
  1.6 实验方案设计  22-24
    1.6.1 实验目的和意义  22
    1.6.2 研究内容  22-23
    1.6.3 技术路线图  23-24
第二章：细胞内表达掌叶半夏凝集素基因抗肿瘤作用的机制  24-56
  2.1 实验材料  24-27
    2.1.1 生化试剂及主要仪器  24-26
    2.1.2 主要质粒、菌株及细胞株  26
    2.1.3 引物  26-27
  2.2 实验方法  27-42
    2.2.1 携带PPA 部分基因的真核表达载体构建  27-31
      2.2.1.1 PEGFP-PPA（Domain A）-C1 载体构建  27-31
      2.2.1.2 PEGFP-PPA（Domain B）-C1 载体构建  31
      2.2.1.3 pcDNA3/flag 以及pcDNA3/flag-PPA 载体构建  31
    2.2.2 细胞内表达基因片段PPA（DomainA、DomainB）亚细胞定位  31-32
    2.2.3 Western blot 检测PPA 在肿瘤细胞中的表达  32-35
    2.2.4 Co-IP、Pulldown 和蛋白染色寻找与PPA 相互作用的蛋白  35-38
    2.2.5 Western Blot 验证互作蛋白的相互作用  38
    2.2.6 PPA 诱导的肿瘤细胞死亡的检测  38-42
      2.2.6.1 非复制型腺病毒的包装、纯化、扩增和滴定  38-41
      2.2.6.2 MTT 法检测肿瘤细胞的存活率  41
      2.2.6.3 结晶紫染色观察病毒对肿瘤细胞的杀伤  41-42
  2.3 实验结果  42-54
    2.3.1 真核表达载体的构建及鉴定结果  42-44
      2.3.1.1 携带PPA 基因片段的pEGFP-PPAn-C1 载体构建及鉴定结果（n=A、A1、A2 和B、B1、B2  42-43
      2.3.1.2 pcDNA3/flag-PPA 载体构建的结果  43
      2.3.1.3 Ad.Surp-PPA 病毒的构建与鉴定  43-44
    2.3.2 携带PPA 基因片段的质粒在细胞内表达的形态观察  44-48
    2.3.3 Western blot 检测PPA 在信号通路方面诱导的细胞死亡  48-49
    2.3.4 CO-IP,Pulldown 找与PPA 相互作用的蛋白  49-51
    2.3.5 Western blot 验证相互作用的蛋白  51-52
    2.3.6 MTT 法检测非复制型病毒Ad.Surp-PPA 对肿瘤细胞的体外杀伤效果  52-53
    2.3.7 结晶紫实验分析非复制型病毒Ad.Surp-PPA 对肿瘤细胞的毒性  53-54
  2.4 讨论与展望  54-56
结论  56-57
参考文献  57-60
致谢  60-61
硕士研究生期间的研究成果  61
硕士研究生期间参与项目与奖励  61

细胞内表达掌叶半夏凝集素基因抗肿瘤的机制研究

内容摘要

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