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昆仙胶囊对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎代谢组学影响的研究

作　者: 鲁莹
导　师: 吴启富
学　校: 南方医科大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 昆仙胶囊狼疮性肾炎 ANA 抗dsDNA 尿蛋白代谢组学
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

一、目的与意义狼疮性肾炎(Lupus nephritis, LN)是系统性红斑狼疮(SLE)累及肾脏所引起的一种免疫复合物肾炎,临床上以发热、关节炎、皮疹及肾脏损害症状为主要表现。约有40%～75%的SLE患者在患病5年内出现临床肾脏受累表现,而肾活检几乎100%有肾脏病理改变。LN是SLE患者最严重的并发症,也是最常见的死亡原因之一,对其进行积极治疗和有效地控制病情进展,至关重要。到目前为止,有关LN的病因和发病机制尚未完全清楚,但其主要的发病过程已得到深入研究：高度活化的B淋巴细胞产生自身抗体,与自身抗原形成免疫复合物是致病的主要因素,相应的细胞因子在发病过程中起辅助作用。近年来,国内外研究发现,细胞凋亡异常,产生核小体,暴露自身隐蔽抗原,可能是发病的主要始动环节。另外,树突状细胞也参与了LN的发病和发展。LN治疗的最终目标是防止疾病的复发,保护肾功能,尽可能减少并发症,促进患者的康复。对LN的早期诊断、早期药物治疗是缓解症状和控制疾病进程的关键。现代医学认为,LN的治疗原则应包括免疫抑制治疗和支持治疗,免疫抑制治疗的强度应根据临床表现、血清学检查结果及肾脏病变的组织学活性确定。支持治疗包括严格控制高血压和高脂血症,及其他防治慢性肾脏病(CKD)的治疗手段。虽然西药能在一定程度上控制疾病的活动和发展,但许多药物不良反应明显,停药后病情易复发,且价格昂贵,为此我们有必要结合中医药治疗LN。中医无系统性红斑狼疮病名,但其临床表现在文献中有类似描述,如“蝴蝶斑”、“阴阳毒”、“日晒疮”等,而狼疮性肾炎则见于“水肿”、“虚损”等病证中。目前,不少医家根据中医理论对LN的病因、病机、辨证论治等方面进行了长期而广泛深入的讨论,形成了较完善的理论体系。多数学者认为,LN起于先天禀赋不足、肝肾阴虚,在情志内伤、劳倦过度、六淫侵袭、阳光暴晒等诱发因素的作用下,导致热毒内盛或瘀血阻络,内侵脏腑而成。在LN病情发展过程中,无论活动期、缓解期和恢复期,中医辨证“肾虚”始终存在。故治疗应以补肾固本贯穿始终。在临床治疗上,发挥中医药多靶点治疗疾病的优势,可以提高本病的整体疗效。因此,如何利用传统中医药的特长,对这一难治性疾病进行有效的治疗,是研究LN的重要课题之一。代谢组学是一门在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质的科学。应用核磁共振(NMR)、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱—质谱(GC-MS)等高通量、高分辨、高灵敏度的现代仪器分析手段,获得体液中代谢产物的信息。通过代谢组学方法,研究生物体内所有代谢产物(主要是低分子量代谢物)在疾病或外源性物质等因素扰动下的动态变化,可以反映生物体的病理生理变化趋势,进而揭示其变化的机制。因此,代谢组学对研究疾病的发病、诊断、药物治疗有着直接意义。昆仙胶囊是由昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟丝子组成,具有温阳益肾,活血祛风除湿等功效。其主要成分昆明山海棠(THH)是卫矛科雷公藤属药物,与中药雷公藤含有多种相同的活性成分,具有抗炎和免疫抑制作用。近20年来,THH被广泛应用于治疗类风湿关节炎、纤维组织炎、红斑狼疮、慢性肾炎等多种结缔组织病及自身免疫性疾病。昆仙胶囊作为一种新型免疫抑制剂,对慢性肾脏病引起的蛋白尿均有较好的疗效,并且治疗期间无严重的肝、肾功能损害或白细胞降低等情况,服用较安全,已在临床上广泛应用于狼疮性肾炎的治疗。目前,尽管对昆仙胶囊已经有大量的临床疗效报道,但是实验研究相对滞后。所以,应该加强对昆仙胶囊作用机理的研究,为有效利用其药效作用和防治、拮抗不良反应做好基础。MRL/lpr小鼠是一种先天性免疫缺陷小鼠,是常用的SLE动物模型之一。MRL/lpr小鼠的症状与人类红斑狼疮相似,包括显著的血清自身抗体,免疫复合物肾小球肾炎,血管炎等。通过对其研究阐明了人类LN发病机制中的很多问题,对当前发展新的诊疗方法有重要意义。为了验证昆仙胶囊对LN的治疗作用,为临床应用提供实验依据,本实验采用MRL/lpr小鼠狼疮肾炎模型,观察昆仙胶囊对狼疮肾炎小鼠血清抗体,蛋白尿,免疫器官的影响及小鼠血清的代谢表型改变,并对其作用机理进行初步探讨。二、方法和内容2.1研究对象将18只12-14周龄MRL/lpr小鼠随机分为三组：模型对照组6只；昆仙胶囊组6只；来氟米特组6只。分别给予生理盐水；昆仙胶囊0.234mg/g/d；来氟米特片0.0026mg/g/d。各组小鼠每天固定时间灌胃,连续给药4周。2.2一般情况每周记录小鼠体重并观察各组小鼠精神状态、食量、活动、关节、毛色等一般情况。2.3尿蛋白及血清抗体检测给药前后测尿蛋白浓度及血清ANA、抗dsDNA抗体的含量。2.4小鼠免疫器官重量测定末次给药24h后称体重,放血处死小鼠,摘胸腺、脾脏、称其湿重,分别计算脾指数和胸腺指数(mg/10g)。脾(胸腺)指数=10×脾(胸腺)重(mg)/体重(g)。2.5病理组织检查小鼠双肾置于4%中性甲醛溶液中固定,石蜡包埋、切片,作HE染色,进行光镜检查。2.6代谢组学研究用基于1H-NMR技术的代谢组学方法检测用药后各组小鼠血清,观察昆仙胶囊对小鼠血清中代谢产物的影响,并对相应机制进行探讨。2.7数据整理与统计采用SPSS13.0、MestReNova5.3.1及SIMCA-P12.0.1软件包对数据和图谱进行分析。三、结果3.1各组小鼠的一般情况实验开始前,各组小鼠均毛色光滑,饮食、活动、体重无差别。在实验过程中,模型对照组小鼠逐渐出现食欲减退,生长缓慢,活动减少,精神萎靡,反应迟钝等表现。3.2尿蛋白及血清抗体检测3.2.1尿蛋白检测给药前,三组小鼠尿蛋白浓度无显著性差异(P>0.05)。给药4周末,昆仙胶囊组和来氟米特组小鼠尿蛋白浓度与模型对照组比较明显降低(P<0.05,P<0.01);并且两组间比较无显著性差异(P>0.05)。比较各组小鼠实验前后尿蛋白浓度发现,两个治疗组小鼠给药后比给药前尿蛋白浓度均降低(P<0.05,P<0.05)；而模型对照组实验前后比较无显著性差异(P>0.05)。3.2.2血清抗体检测三组小鼠给药前,血清ANA水平及抗dsDNA抗体水平均无显著性差异(P>0.05)。给药后,两个用药组与模型对照组比较,血清抗体水平均明显降低,差异具有显著性(P<0.01,P<0.01)。与给药前比,模型对照组ANA水平在给药4周末无明显变化(P>0.05),而抗dsDNA抗体；水平显著升高(P<0.01)；昆仙胶囊组与来氟米特组给药后血清ANA水平均明显降低,差异具有显著性(P<0.01,P<0.01),抗dsDNA抗体水平虽比给药前有所升高,但是显著低于同时间模型对照组抗体水平(P<0.05)。3.3免疫器官重量测定结果昆仙胶囊组胸腺指数明显升高,与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),但脾指数与模型对照组相比无显著差异。来氟米特组脾指数明显上调(P<0.05)。3.4肾脏病理学检查光镜下观察到模型对照组小鼠肾小球系膜细胞、内皮细胞呈轻中度增生,而两个给药组小鼠肾脏病变均较模型对照组有所减轻(P<0.01)。3.5代谢组学改变两个给药组跟模型对照组比较发现,支链氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、酮体、柠檬酸、肌酸、磷酸胆碱、牛磺酸、葡萄糖等代谢组分发生改变。四、结论4.1通过观察昆仙胶囊对LN模型小鼠免疫学指标及肾脏病理改变的影响,发现昆仙胶囊可以显著降低自身抗体及尿蛋白水平；并能调节免疫器官,控制肾脏病理损害的进展。提示昆仙胶囊能够控制LN的活动,缓解病情。4.2用基于1H-NMR技术的代谢组学方法检测用药后各组小鼠血清,研究结果显示,昆仙胶囊组小鼠血清跟模型对照组比较,支链氨基酸、丙氨酸、糖蛋白、柠檬酸、磷酸胆碱、牛磺酸、葡萄糖含量升高；而酮体、肌酸等代谢组分含量则低于模型对照组。推测昆仙胶囊发挥作用的机制包含以下几个方面：一、促进机体正常能量代谢以及增强机体抗氧化能力、免疫力；二、稳定细胞膜,维持细胞内外渗透压平衡；三、改善肾功能；四、控制体内细胞的异常凋亡。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
第一章理论研究  16-29
  第一节现代医学对LN的研究及治疗  16-21
    1 现代医学对LN的研究进展  16-20
    2 现代医学对LN的治疗  20-21
  第二节中医学对LN的研究及治疗  21-24
    1 中医学对LN病因病机的研究  21-22
    2 中医学对LN辩证论治的研究  22-24
  第三节代谢组学的发展及应用  24-25
    1 代谢组学的发展  24
    2 代谢组学的研究方法  24-25
    3 代谢组学在药物作用机制研究中的应用  25
  第四节昆仙胶囊的相关性研究  25-27
    1 抗炎作用  26
    2 免疫调节  26-27
    3 对细胞增殖及凋亡的作用  27
  第五节 MRL/lpr小鼠模型  27-29
    1 临床与组织学特征  28
    2 自身抗体  28
    3 免疫细胞异常  28-29
第二章实验研究  29-47
  第一节昆仙胶囊对狼疮性肾炎小鼠的免疫调节作用  29-38
    1 材料与方法  29-32
    2 结果  32-36
    3 结论  36-38
  第二节昆仙胶囊作用机理的代谢组学研究  38-47
    1 材料与方法  38-40
    2 结果  40-44
    3 结论  44-47
全文小结  47-48
参考文献  48-56
缩略词对照表  56-58
论文发表情况  58-59
致谢  59-61
统计学审稿证明  61

昆仙胶囊对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎代谢组学影响的研究

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