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Mitofusin2基因抑制大鼠血管平滑肌细胞A7r5增殖的研究

作　者: 席少静
导　师: 何军
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 内科学
关键词: 线粒体融合蛋白基因2 A7r5细胞 细胞增殖 Ras-Raf-ERK1/2 Ras-PI3K-AKT
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


5目的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)异常增殖在血管增生性疾病中扮演着十分重要的角色,是动脉粥样硬化形成、高血压、冠心病、经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄的病理基础。细胞生长因子、炎症因子、血流动力学异常等通过相关的细胞信号转导路径,特别是通过激活Ras原癌基因及其所介导的Ras-Raf-MAPK和Ras-PI3K-Akt信号转导路径,引起VSMC过度增殖。因此,阻扰这些路径,抑制细胞异常增殖,是防治血管增生性疾病的有效途径。线粒体融合蛋白2(mitofusin2, Mfn2)基因是近年来发现的一种新型的增殖抑制基因,它不仅抑制多种肿瘤细胞的增殖,并且参与线粒体的融合、调节线粒体的新陈代谢、维持线粒体的网状结构。在高血压大鼠和球囊损伤后再狭窄大鼠主动脉VSMC中Mfn2的表达均下降,因此上调Mfn2的表达可能会抑制该病理过程。本研究拟应用基因克隆和基因重组等方法,观察外源性Mfn2基因对A7r5细胞增殖的影响,并对其分子机制进行探讨,以期为mfn2成为血管增殖性疾病的治疗靶点提供实验依据。方法通过RT-PCR获得大鼠Mfn2 CDS序列的cDNA,扩增、纯化、回收Mfn2基因片段并与载体pGEM-T连接成重组克隆载体pGEM-T-mfn2,转化入E.coli DH5α感受态细胞大量扩增并行氨苄青霉素筛选。用HindⅢ和BamHⅠ双酶切扩增的大鼠Mfn2基因片段和质粒pEGFP-N1,再将回收的pEGFP-N1大片段与Mfn2基因片段重组,转化感受态DH5α。采用质粒小提产物PCR、HindⅢ和BamHⅠ双酶切和序列分析方法,确定目标片段的存在和序列正确性。将测序正确的重组质粒pEGFP-mfn2在阳离子脂质体的介导下体外转染A7r5细胞,将细胞分成三组:空白对照组A7r5(未转染组),空载体对照组(pEGFP-N1组,转染空质粒),实验组(A7r5-Mfn2-GFP组,转染pEGFP-mfn2)。24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达情况,分别于转染后48h收获三组细胞,经RT-PCR、Western blot方法检测Mfn2在A7r5细胞的表达情况。转染成功且效率稳定后,通过细胞计数法、MTS法检测Mfn2对A7r5增殖的影响。流式细胞术分析外源性Mfn2基因在体外对A7r5细胞周期分布的影响。Western blot检测三组细胞的磷酸化Raf、磷酸化ERK1/2和磷酸化AKT蛋白表达的变化,采用方差分析对数据进行统计学处理。结果从A7r5细胞总RNA中经RT-PCR扩增出一条约2.2kb的片段。重组质粒转化感受态DH5α后,通过抗性基因筛选出阳性克隆。质粒小提产物PCR显示存在2.2kb的特异性条带;酶切结果显示重组质粒被切成4.7kb大小的pEGFP-N1载体和2.2kb大小的目的片段;经测序,目的片段的序列与GeneBank中大鼠Mfn2基因的编码序列完全一致;进一步证实成功地构建了含大鼠Mfn2基因的重组真核表达载体。荧光显微镜下观察,转染成功的A7r5细胞中有GFP表达,发出特异性的荧光。按转染率=暗视野所见发绿色荧光的细胞数/明视野所见细胞总数×100%,计算转染率为70%。RT-PCR及Western blot证实转染pEGFP-mfn2组的A7r5细胞中Mfn2mRNA和蛋白表达较对照两组高。细胞计数法、MTS法检测转染pEGFP-mfn2组细胞数明显低于空白对照组和空载体对照组(P<0.05),而对照两组细胞数无明显差异。转染后48h流式细胞仪检测结果表明实验组中多数VSMC停滞于GI期,细胞比例为61.733±3.755,与对照组相比差异有统计学意义(F=109.8,P<0.05),两对照组相比差异无统计学意义。Western blot结果显示:实验组细胞与两对照组细胞相比,转染后48h磷酸化c-Raf(p-c-Raf),磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化AKT(p-AKT)的表达水平明显降低,其差异有显著性(P<0.05)。结论1. Mfn2基因过表达可以明显抑制A7r5细胞的增殖。2. Mfn2基因抑制A7r5细胞增殖的机制可能是通过抑制Ras-Raf-ERK1/2和Ras-PI3K-AKT信号通路,下调磷酸化Raf-1蛋白,磷酸化ERK1/2蛋白和磷酸化AKT蛋白的表达来实现的。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-15
第一部分 Mfn2 基因克隆及重组真核表达质粒的构建  15-36
  材料与方法  15-27
  结果  27-29
  讨论  29-31
  附图  31-35
  参考文献  35-36
第二部分 Mfn2 基因对大鼠血管平滑肌细胞A7r5 增殖的影响及其作用机制  36-60
  材料与方法  36-48
  结果  48-51
  讨论  51-53
  附图  53-57
  参考文献  57-60
综述  60-70
  综述参考文献  66-70
致谢  70-72
攻读学位期间发表的学术论文  72

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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