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丙烯酰胺对猪骨髓间充质干细胞NFκB通路的影响

作　者: 陶晓莉
导　师: 龙良启
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: BMMSCs 猪丙烯酰胺 Hsp27 NFκB
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

骨髓间充质干细胞(BMMSCs)具有免疫调节功能,参与多种免疫反应,在体内具有优先迁移到受损组织器官发挥其修复功能的能力。现阶段的BMMSCs体外分离方法是建立在Friedenstein分离方法的基础上形成的。目前,由于BMMSCs的鉴定没有一种明确统一的体系,只能从几个方面综合分析来作为其鉴定的依据。丙烯酰胺(ACR)具有致癌性、遗传毒性以及神经毒性。本试验通过BMMSCs的分离鉴定,建立BMMSCs的体外培养体系,并探讨ACR对BMMSCs上ROS、Hsp27以及NFκB通路的影响,以期为ACR的作用机制研究提供一条新的线索。本文采用全骨髓贴壁法体外分离0-6月龄五指山小型猪BMMSCs,并利用CCK-8检测其增殖能力。BMMSCs的鉴定是通过细胞形态学分析、成脂成骨诱导分化潜能鉴定以及CD34/CD45/CD90/CD29/CD44细胞表面抗原的检测等几种指标综合分析。使用0.5mmM的ACR刺激BMMSCs 72 h,分别用ROS检测试剂盒检测ROS分泌量、ELISA试剂盒在蛋白水平检测Hsp27和IL-8表达量、实时定量PCR在mRNA水平上检测IL-8的表达量、双荧光素酶系统检测NFκB通路的激活状况,并用试剂盒检测ACR处理前后BMMSCs的细胞周期和凋亡状况。结果表明分离得到的五指山小型猪BMMSCs形态呈梭形或多角形,类似成纤维样细胞,细胞群体呈旋涡状生长。成脂、成骨诱导培养21d分别用油红O及茜素红染色均呈阳性。流式细胞仪检测显示,BMMSCs表达CD90、CD29及CD44,不表达造血干细胞标志性抗原CD34和白细胞标志性抗原CD45。0.5 mM的ACR刺激BMMSCs 72 h后检测其ROS、Hsp27、IL-8表达量均明显升高,双荧光素酶系统检测到NFκB通路被激活(P<0.05)。然而,ACR刺激后BMMSCs的细胞周期和凋亡未见明显变化。总之,本文摸索出五指山小型猪BMMSCs一套分离培养体系,通过形态学分析、分化潜能以及表面抗原三个方面检测,基本确定其为骨髓间充质干细胞。当0.5 mMACR刺激时,ROS、Hsp27及IL-8表达量均升高,细胞质中NFκB含量显著升高,说明NFκB通路可能被激活,而细胞凋亡和周期变化不明显。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
缩略词表  8-9
前言  9-14
第一章五指山猪骨髓间充质干细胞分离培养以及鉴定  14-30
  1 导言  14
  2 材料与方法  14-22
    2.1 材料和仪器耗材  14-17
      2.1.1 材料与试剂  14-15
      2.1.2 主要溶液的配制  15-16
      2.1.3 试验用仪器设备  16
      2.1.4 耗材  16-17
    2.2 方法  17-22
      2.2.1 猪BMMSCs体外分离培养  17-18
      2.2.2 细胞增值能力测定  18-19
      2.2.3 分化潜能鉴定  19
      2.2.4 定量PCR  19-21
      2.2.5 表面抗原鉴定  21-22
      2.2.6 统计学处理  22
  3 结果  22-27
    3.1 BMMSCs的分离培养与纯化及形态学观察  22-23
    3.2 BMMSCs的生长曲线  23-24
    3.3 BMMSCs体外诱导分化成成骨样及成脂肪细胞  24-25
    3.4 PCR检测成脂及成骨相关基因诱导前后表达量的变化  25-26
      3.4.1 RNA样品质量检测  25
      3.4.2 cDNA样品质量检测  25
      3.4.3 实时定量PCR  25-26
    3.5 流式细胞仪检测BMMSCs表面抗原  26-27
  4 讨论  27-30
第二章 ACR对五指山猪骨髓间充质干细胞NFκB通路的影响  30-44
  1 导言  30
  2 材料与方法  30-36
    2.1 所用试剂盒  30
    2.2 方法  30-36
      2.2.1 试剂盒检测ACR处理前后BMMSCs的ROS分泌量的变化  30-31
      2.2.2 ELISA检测ACR处理前后Hsp27分泌量的变化  31-32
      2.2.3 ELISA检测ACR处理前后IL-8分泌量的变化  32-33
      2.2.4 ACR刺激前后细胞周期检测  33
      2.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡  33-34
      2.2.6 双荧光素酶检测NFKB通路  34-35
      2.2.7 荧光定量检测ACR刺激前后IL-8的表达量的变化  35
      2.2.8 统计学处理  35-36
  3 结果  36-40
    3.1 ACR刺激后ROS分泌量的检测  36
    3.2 ELISA检测Hsp27分泌量的变化  36-37
    3.3 ELISA检测IL-8分泌量的增加  37
    3.4 定量PCR在mRNA水平上检测IL-8表达量的变化  37-38
    3.5 双荧光素酶系统检测NFKB通路的激活  38-39
    3.6 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡  39-40
      3.6.1 BMMSCs的细胞周期  39-40
      3.6.2 细胞凋亡  40
  4 讨论  40-44
参考文献  44-50
研究生期间发表的论文  50-51
致谢  51

丙烯酰胺对猪骨髓间充质干细胞NFκB通路的影响

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