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MicroRNAs对细胞信号转导调控的研究

作　者: 张东泽
导　师: 袁文俊
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 生理学
关键词: microRNA-126 胰岛素信号通路 INS-1细胞 Ⅱ型糖尿病 细胞增殖 microRNA ETS-1 AT1R 炎症 HUVEC 细胞迁移 动脉粥样硬化
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


随着人类生活水平和生存环境的改变,代谢与内分泌疾病的发病率逐年上升。糖尿病是其中最常见的一种慢性疾病,其主要特征是血糖代谢的紊乱,分为Ⅰ型及Ⅱ型糖尿病,临床上95%以上患者为Ⅱ型糖尿病(T2DM)。近年来的研究发现Ⅱ型糖尿病发病的主要原因是胰岛素抵抗,其贯穿于Ⅱ型糖尿病的整个过程。虽然多项研究结果提示胰岛素抵抗与激素因子、炎症反应及内质网应激等共同作用有关,但关于胰岛素抵抗的具体机制尚不明确。MicroRNAs (miRNAs)是一大类进化保守的小分子非编码RNAs,典型的miRNAs由20-25个单核苷酸组成,miRNAs可通过序列特异性的方式与特定靶基因的3’端非编码区(3’UTR)相互作用来调节靶基因的蛋白表达,从而发挥其生物学功能。许多miRNA与Ⅱ型糖尿病的发展有着密切的关系。Zampetaki等监测到,健康人且后来发生糖尿病的那些患者其血浆中有多种miRNAs的水平逐渐发生变化,如microRNA-126(miR-126)在糖尿病人血浆中的含量明显减少。因此,我们认为miR-126与Ⅱ型糖尿病的发生、发展可能有密切关系。鉴于目前miR-126与Ⅱ型糖尿病发病机制尚不明确,本课题在INS-1细胞(大鼠胰岛β细胞株)应用miRNA的过/低表达及功能研究等方法,探讨了miR-126对胰岛素信号通路的调控作用及机制。目的本课题旨在研究miR-126对INS-1细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制,为Ⅱ型糖尿病的发生、发展提供新的理论基础及潜在的治疗靶点。方法生物信息学方法预测miR-126的潜在靶基因。以培养的INS-1细胞为模型,将人工合成的miR-126模拟物进行转染,并用实时荧光定量PCR方法及荧光显微镜检测转染效率。转染48小时后的INS-1细胞用人工合成胰岛素(100nM)刺激12小时,提取细胞总蛋白进行BCA蛋白定量。利用Western Blot方法检测miR-126对预测靶基因蛋白表达的影响;利用MTT法检测miR-126对INS-1细胞增殖的影响。结果通过生物信息学检索PicTar、BibiServ等软件发现:在胰岛素受体底物-1(IRS-1)及PIK3R2 mRNA的3’非翻译区(3’UTR)存在miR-126的潜在结合位点,二者与miR-126结合自由能分别为?19.3和?19.4 kcal/mol,提示miR-126可能调控IRS-1及PIK3R2 mRNA的表达。为了干预内源性miRNA的表达,我们将人工合成miR-126模拟物转染INS-1细胞48小时,定量PCR结果显示:人工合成的miRNA模拟物在体外可有效调节内源性miRNA的表达。为进一步证明IRS-1和PIK3R2是miR-126的靶点,我们将INS-1细胞分别转染miR-126 mimics、miR-126 mutation、miRNA control mimics或Si-IRS1 48小时后用100nM胰岛素刺激12小时,Western blot结果显示:转染miR-126 mimics以及Si-IRS1组IRS-1、PIK3R2及Akt蛋白表达明显下调。另外,我们用100nM胰岛素不同时间段(0分钟、1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、60分钟)刺激INS-1细胞,用Western blot方法检测Akt蛋白磷酸化水平,结果显示:胰岛素可时间依赖性促进INS-1细胞Akt磷酸化效应,而Akt蛋白表达无明显变化。另外,为进一步探讨miR-126与INS-1细胞功能的关系,我们将INS-1细胞分别转染miR-126 mimics、miRNA control mimics(CTm)或Si-IRS1 48小时后用100nM胰岛素刺激12小时,利用MTT法检测INS-1细胞的增殖情况,结果显示:与对照组相比,过表达miR-126组INS-1细胞的增殖明显受到抑制,其抑制率达30.05%。结论IRS-1和PIK3R2 mRNA是miR-126的靶点,miR-126通过作用于IRS-1及PIK3R2基因3’端非编码区上特异性靶序列抑制INS-1细胞IRS-1、PIK3R2及下游Akt蛋白的表达;胰岛素可时间依赖性促进INS-1细胞Akt磷酸化效应;miR-126可能以IRS-1及PIK3R2为靶点抑制IRS-1/PI3K/Akt信号通路,从而抑制INS-1细胞的增殖。炎症反应贯穿于动脉粥样硬化的各个阶段。其初期特征是白细胞的聚集和内皮细胞(ECs)的激活。MicroRNAs(miRNAs)是一大类进化保守的小分子非编码RNAs,典型的miRNA由20-25个单核苷酸组成,miRNAs可通过序列特异性的方式与特定靶基因的3’端非编码区(3’UTR)相互作用来调节基因表达,然而miRNAs与内皮功能的关联尚不清楚。本课题组前期研究发现miR-155和miR-221/222在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及血管平滑肌细胞(VSMCs)高度表达。Ets-1是与炎症及血管腔形成联系密切的一种重要转录因子,通过生物信息学检索发现:ETS-1 mRNA的3’非翻译区存在miR-155和miR-221/222的潜在结合位点;Western blot实验也证明:在HUVECs中miR-155和miR-221以ETS-1为靶点发挥对靶基因的调控作用;另外,血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)也是miR-155的靶点。定量PCR结果显示:HUVECs中血管紧张素Ⅱ(AngII)刺激Ets-1及其下游基因(包括VCAM1, MCP1 and FLT1)表达上调,这种作用可部分被miR-155及miR-221/222的过表达逆转;miR-155以AT1R为靶点,可减少AngII引起的HUVECs细胞迁移。总之,我们的研究发现HUVECs高表达的miR-155可能以AT1R及Ets-1为共同靶点,而miR-221/222则以Ets-1为靶点,它们对内皮细胞多种炎症分子的表达起调节作用,并且可调节HUVECs的迁移。这些结果为动脉粥样硬化提供了新的理论依据及潜在治疗靶点。

全文目录


英文缩写及英汉全称  5-7
第一部分 MicroRNA-126对INS-1细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制  7-12
  摘要  7-9
  ABSTRACT  9-12
第二部分 MiR-155和miR-221/222 对血管紧张素Ⅱ诱导的内皮炎症及迁移的调节作用及机制  12-14
  摘要  12-13
  Abstract  13-14
第一部分 MiR-126 对INS-1 细胞胰岛素信号通路的调控作用及机制  14-58
  前言  14-20
  材料和方法  20-39
  结果  39-49
  讨论  49-53
  结论  53-54
  参考文献  54-58
第二部分 MiR-155和miR-221/222对血管紧张素Ⅱ诱导的内皮炎症及迁移的调节作用及机制  58-83
  前言  58-60
  材料和方法  60-66
  结果  66-76
  讨论  76-78
  结论  78-79
  参考文献  79-83
综述 MicroRNAs 与心血管疾病  83-98
  综述参考文献  93-98
致谢  98-100
在读期间发表论文情况  100

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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