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伽玛刀照射对匹罗卡品致痫大鼠DBP-ERK1/2信号通路的影响

作　者: 霍文滔
导　师: 梁军潮
学　校: 南方医科大学
专　业: 神经外科
关键词: 伽玛刀癫痫锂-匹罗卡品白蛋白-D位点结合蛋白磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶
分类号: R742.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

【背景】癫痫是常见的神经系统疾病,据统计目前世界上至少有5千万癫痫患者,在我国的患病率约为4%0。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)由颞叶病灶所引起,是各种癫痫综合征最常见的类型,严重影响患者正常的生活、工作和学习,成为中枢神经系统疾病中的一大顽症。抗癫痫药物通常是首选治疗手段,然而在所有患者中大约有30%-50%属于药物难治性癫痫,需要考虑外科干预治疗。而外科治疗最关键的问题则是对致痫灶准确定位,准确地查出致痫灶是外科治疗成功的首要条件。随着医学科学的迅猛发展,MRS、皮层脑电、深部脑电,PET、脑磁图(MEG)的应用,致痫灶定位的准确性有了明显的提高。在难治性癫痫的外科治疗方面,源于外科手术治疗的理论基础及实践经验,伽玛刀应用已逐步扩大,伽玛刀放射外科(Gamma knife radiosurgery, GKS)具有定位精确,高能量射线汇聚于靶点,陡峭的辐射衰减梯度,对周围组织损伤小的特点。利用不同直径大小的准直器,多个等中心照射,已成为治疗脑部肿瘤、血管畸形及癫痫等功能性疾病的一种重要方式。人们希望寻找一种低风险、低成本并且效果明显的治疗癫痫的方法。伽玛刀在治疗颞叶癫痫方面进行了一些尝试,它克服了既往开颅手术创伤大、受骨窗限制、并发症高的缺点,在治疗癫痫方面显示了微创不开颅、效果好、并发症少的优点,还可以作为手术治疗癫痫无效的一个补充治疗措施,已越来越多地得到了临床医生的认可。虽然近年来有关立体定向放射外科治疗难治性癫痫的报道日渐增多,但有关癫痫发病机理及其放射外科治疗作用机制尚不明了。迄今人类对癫痫发病机制的研究仍主要靠动物实验。目前癫痫动物模型有一百多种之多,但完全符合人类颞叶癫痫发作特征及病理改变的模型较少,锂一匹罗卡品颞叶癫痫模型就是其中的一种。随着研究方向的深入及试验技术的进步,对颞叶癫痫海马的研究在病理变化、病理生理过程及分子学机制等方面均取得了长足的进步,但依然有许多关键问题尚待解决。海马是颞叶癫痫的解剖起源。海马硬化(hippocampus Sclerosis, HS)是颞叶癫痫最常见的病理变化,包括神经细胞丢失、胶质细胞增生、苔藓纤维出芽及突触重组。海马神经元突触重组及齿状回颗粒细胞轴突(苔藓纤维)出芽形成异常神经网络是癫痫反复发作的主要环节。颞叶癫痫形成过程实际上是海马可塑性神经网络重建的过程。前期研究表明,MFS和突触重组在癫痫发病机制中具有重要作用。白蛋白-D位点结合蛋白(albumin D-site-binding protein, DBP)在颞叶癫痫发病机制中有重要的作用。白蛋白-D位点结合蛋白是一种具有拉链结构的转录因子,形成二聚体后与启动子结合,促进转录。白蛋白-D位点结合蛋白以含有碱性/亮氨酸拉链(PARb Zip)结构为特征,是具有PARb Zip保守区的转录因子,参与基因的转录调控。过度表达的白蛋白-D位点结合蛋白可以诱导细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)激活,磷酸化后维持其活性。白蛋白-D位点结合蛋白还可能通过细胞外信号调节蛋白激酶途径参与癫痫的发生。细胞外信号调节蛋白激酶信号传导通路属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)家族中的一员。细胞外信号调节蛋白激酶信号传导通路对神经活动高度敏感,可以通过调节下游基因表达和蛋白合成等影响突触重塑、苔藓纤维重组等。细胞外信号调节蛋白激酶信号通路可能在难治性癫痫发病机制中起一定作用。本研究用氯化锂-匹罗卡品成功将SD大鼠致癫痫后,以白蛋白-D位点结合蛋白为切入点,检测伽玛刀照射后颞叶癫痫大鼠海马区白蛋白-D位点结合蛋白及细胞外信号调节蛋白激酶磷酸化后的表达情况,以进一步了解DBP-ERK1/2信号通路在匹罗卡品点燃癫痫病理过程中的作用,并初步探讨伽玛刀照射匹罗卡品致痫大鼠的作用机制,以期为临床治疗癫痫寻找到更好的作用靶点。[目的]1.制作匹罗卡品诱发SD大鼠癫痫模型,观测与癫痫发生有关的信使指标,如DBP、p-ERK1/2表达,探讨癫痫发生机理；2.采用伽玛刀照射癫痫模型鼠,研究伽玛刀的作用机制。[方法]1.SPF级健康成年SD大鼠110只,分为生理盐水对照组(腹腔注射生理盐水),非伽玛刀照射致痫模型组(匹罗卡品致痫大鼠模型鼠不给予伽玛刀照射),伽玛刀照射致痫模型组(匹罗卡品致痫大鼠模型鼠给予伽玛刀照射),各组又按照伽玛刀照射后处死时间3h,7d,15d,30d,60d,分为5个亚组,每亚组6只行白蛋白-D位点结合蛋白及磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶表达的检测,另生理盐水对照组与非伽玛刀照射致痫模型组每亚组2只行尼氏染色。2.锂-匹罗卡品癫痫模型建立。实验组大鼠依次给予氯化锂、硫酸阿托品、匹罗卡品腹腔注射诱发癫痫持续状态(status epilepticus, SE),持续1h后注射地西泮终止发作。其后每天观察其自发性痫性发作(spontaneous recurrent seizures, SRS)。生理盐水对照组在与氯化锂-匹罗卡品实验组大鼠相同的时间点,给予大鼠腹腔注射生理盐水125mg/kg,注射后也立即开始观察大鼠的行为学变化。3.设计制作大鼠伽玛刀定位头架。动物固定架选用无磁性高强度的有机玻璃板、布胶板、硬橡胶棒等作为材料,主体为一块有机玻璃固定板,板上面头端装有固定动物头部的装置,采用3点定位固定,由两侧的耳塞及前端固定牙齿的装置组成,均可随意调节。固定板下面巧妙地设计了4个支柱,可牢靠固定在Leksell框架后面两个竖柱上。4.伽玛刀照射。伽玛刀照射致痫模型组在10%水合氯醛麻醉下,被固定于伽玛刀专用大鼠固定架上,用磁共振成像(MRI)进行脑冠状面的连续扫描,计算确定照射靶区为左侧海马的X.Y.Z的座标。然后将大鼠固定架连接于4mm准直器上,调整好座标,用伽玛刀实施照射,周边剂量12Gy,等剂量曲线为50%,中心剂量为24Gy。5.生理盐水对照组和非伽玛刀照射致痫模型组海马组织病理检测。分别于上述5个不同时间点分批处死大鼠取左侧海马组织标本,行冠状冰冻切片,切取8um薄片和25um厚片,直接贴在多聚赖氨酸包被的载玻片上,行Nissl染色。镜下观察海马区域的病理改变。6.Western blotting法检测DBP蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达情况。各组于上述5个不同时间点分批处死大鼠取左侧海马组织标本,常规按Santa Cruz试剂盒总蛋白提取方法提取组织总蛋白、电泳、转膜、免疫杂交与显色。ECL发光法显示特异条带,可达胶片暗盒曝光、显影、定影,将条带用计算机成像系统采集,用Image Tool 5.0测定分析条带灰度值,并与内参灰度值相比,得到相对比值作为目标蛋白的表达水平,取重复实验的结果均值进行统计学分析。7.所得数据以均数±标准差(X±s)表示,所有数据均应用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。对完全随机设计的计量资料采用完全随机分组两因素析因设计资料的方差分析,方差齐时采用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时采用Dunnett’s T3法进行组间多重比较；本研究中规定显著性水平α=0.05,P<0.05认为差异具有统计学意义。[结果]1.行为学观察。行为学观察发现可见致痫大鼠出现Ⅰ-Ⅳ级的反复自发性痫性发作,有时甚至可见到Ⅴ级的SRS。一般持续30s左右,均可自行终止。本研究的后期,伽玛刀照射致痫模型组大鼠较非伽玛刀照射致痫模型组大鼠自发性痫性发作次数减少。2.Niss1染色显示。非伽玛刀照射致痫模型组大鼠左侧齿状回、门区、CAl区、CA3区可见胞浆尼氏小体减少、细胞轮廓模糊、排列紊乱、神经元数量减少,齿状回颗粒细胞层边界不整齐、增宽、排列松散、紊乱,以上变化随着时间的延长更加明显。3.匹罗卡品点燃模型后大鼠海马区的白蛋白-D位点结合蛋白被激活,并随时间出现有规律的变化,在各时间点模型组大鼠海马区白蛋白-D位点结合蛋白的表达与生理盐水对照组相比具有统计学差异(P<0.05),而伽玛刀照射能抑制这种激活(P<0.05)。海马区细胞外信号调节蛋白激酶磷酸化后的变化呈现与白蛋白-D位点结合蛋白相似的规律。[结论]1.匹罗卡品点燃癫痫模型后海马区的DBP-ERK1/2信号通路被激活。2.伽玛刀照射能抑制DBP-ERK1/2信号通路激活,伽玛刀照射对DBP-ERK1/2信号通路的影响可能是其治疗颞叶癫痫的作用机制之一

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-20
材料与方法  20-33
  1.1 实验动物  20
  1.2 主要实验材料  20-21
  1.3 主要实验设备  21-22
  1.4 实验方法  22-33
结果  33-40
  2.1 行为学观察结果  33-34
  2.2 组织病理学研究结果  34-36
  2.3 大鼠海马组织DBP蛋白各时间点的表达  36-37
  2.4 大鼠海马组织p-ERK1/2蛋白各时间点的表达  37-40
讨论  40-52
  3.1 锂-匹罗卡品颞叶癫痫模型  40-42
  3.2 颞叶癫痫病理改变  42-44
  3.3 伽玛刀放射治疗癫痫  44-46
  3.4 DBP与癫痫  46-49
  3.5 p-ERK1/2与癫痫  49-52
小结  52-53
参考文献  53-61
主要英文缩略语(符号表)  61-62
在读期间撰写论文情况  62-63
致谢  63-65
统计学证明  65

伽玛刀照射对匹罗卡品致痫大鼠DBP-ERK1/2信号通路的影响

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