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初步分离和鉴定四种肿瘤细胞系的肿瘤干细胞

作　者: 吴长清
导　师: 杨世华
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 端粒酶阴性肿瘤干细胞侧群低粘附培养致瘤性分化
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肿瘤是导致人类死亡的主要原因之一,目前治疗肿瘤的主要措施是手术治疗和抗增殖的治疗方法,但这些治疗方式常常发生不可预测的恶性肿瘤细胞转移,给根治肿瘤带来了障碍。近期发现在肿瘤组织中存在着一小群具有高致瘤能力的细胞,这些细胞可能源自于正常干细胞的转化。越来越多的证据表明,肿瘤的生长与转移需要这一少量的细胞亚群,它们具有干细胞的特征,被称为“肿瘤干细胞”(cancer stem cells,CSC)。目前仅见有关端粒酶阳性的肿瘤中分离肿瘤干细胞,但端粒酶阴性肿瘤中是否也具有肿瘤干细胞在国内外尚未见报道。本研究以三种端粒酶阴性的骨肉瘤细胞系U-2OS、Saos-2和SCID22-3B-1,一种肺癌细胞系XWLC-05为研究对象,利用细胞贴壁、低粘附培养、软琼脂培养以及细胞单克隆培养方法检测细胞的体外增殖特性、以侧群(side population, SP)的分选方法和CD133免疫荧光染色探讨肿瘤细胞系中潜在的肿瘤干细胞,并以在SCID小鼠或者裸鼠体内验证各种细胞成瘤能力验证是否具有肿瘤干细胞特性。结果发现从SCID22-3B-1和XWLC-05中分离出0.3%和2%左右的肿瘤干细胞样细胞,且只有XWLC-05中的侧群细胞在裸鼠体内具有高度的致瘤性,2000个细胞便可致瘤,而该种细胞系则至少需要1×105个细胞可致瘤,并都可继代致瘤。在U-2OS、Saos-2和SCID22-3B-1中未检测到CD133阳性细胞。从肺癌细胞系及其侧群细胞中分离的单克隆细胞株,都含有侧群细胞,都具有较强的致瘤性,并都出现了分化现象；使用低粘附的培养方法,未发现侧群细胞含量明显的增加。在软琼脂试验中,U-2OS、Saos-2和SCID22-3B-1三种细胞系无法成细胞球,而XWLC-05可以成球团生长,其成球团能力与是否具有成瘤性侧群细胞有关。本研究发现U-2OS、Saos-2(?)(?)SCID22-3B-1三种端粒酶阴性肿瘤细胞系可能不存在肿瘤干细胞；其次XWLC-05具有较强的成瘤性,可以分离获得强致瘤性的肿瘤干细胞。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
插图和附表清单  10-12
第一章前言  12-26
  1.1 肿瘤疾病的现状  12
  1.2 肿瘤特征及发病原因  12-13
  1.3 肿瘤干细胞的发现  13-14
  1.4 干细胞与肿瘤干细胞  14
  1.5 肿瘤干细胞的来源  14-16
    1.5.1 正常干细胞的突变  15
    1.5.2 祖细胞的突变  15
    1.5.3 体细胞的突变  15
    1.5.4 细胞融合  15-16
  1.6 端粒酶阴性细胞系中是否存在肿瘤干细胞  16-19
    1.6.1 端粒与端粒酶  16
    1.6.2 端粒延长的替代机制  16-17
    1.6.3 端粒酶检测技术  17-19
  1.7 肿瘤干细胞的分离方法  19-20
  1.8 肿瘤干细胞特性的研究  20-21
    1.8.1 CD133的研究  20-21
    1.8.2 CD44的研究  21
  1.9 肿瘤干细胞的分子调控机制  21-24
    1.9.1 IL-4通路  21-22
    1.9.2 Wnt通路  22
    1.9.3 Notch通路  22
    1.9.4 miRNA的研究  22-24
  1.10 利用肿瘤干细胞理论治疗癌症的思路  24
  1.11 肿瘤干细胞的研究意义  24-26
第二章材料与方法  26-47
  2.1 材料  26-27
    2.1.1 研究对象  26
    2.1.2 主要试剂  26-27
    2.1.3 主要仪器  27
  2.2 实验流程图  27-28
  2.3 细胞培养方法  28-35
    2.3.1 培养基及相关试剂的配制方法  28-31
    2.3.2 贴壁培养  31
    2.3.3 低粘附培养方法  31
    2.3.4 软琼脂培养方法及克隆率  31-32
    2.3.5 单克隆培养方法  32
    2.3.6 细胞的复苏,传代,冻存和运输  32-34
    2.3.7 细胞的计数与细胞活力的测定  34-35
  2.4 分子检测实验  35-37
    2.4.1 RNA酶污染的预防  35-36
    2.4.2 蛋白的提取及PCR  36-37
  2.5 肿瘤干细胞的分选方法  37-39
    2.5.1 侧群分选  37-38
    2.5.2 免疫荧光染色  38-39
  2.6 移植瘤及其继代方法  39-40
    2.6.1 移植瘤实验  39
    2.6.2 细胞继代培养方法  39-40
  2.7 H&E染色  40-41
  2.8 成纤维细胞的去除  41-47
    2.8.1 酶消化法  41-42
    2.8.2 机械刮除法  42-43
    2.8.3 反复贴壁法  43
    2.8.4 克隆法  43-47
第三章实验结果  47-70
  3.1 端粒酶活性检测  47
  3.2 细胞培养特性  47-58
    3.2.1 细胞培养特性  47-49
    3.2.2 低粘附细胞培养  49-54
    3.2.3 单克隆细胞培养  54
    3.2.4 软琼脂细胞培养  54-58
  3.3 表面抗原CD133分析  58-59
  3.4 SP分选  59-61
  3.5 细胞移植成瘤性分析  61-69
  3.6 移植瘤的组织病理学分析  69-70
第四章讨论  70-74
  4.1 SP方法的优化  70
  4.2 端粒酶阴性细胞系中侧群细胞含量及其原因分析  70-71
  4.3 XWLC-05的侧群细胞性状分析  71-72
  4.4 肿瘤细胞的耐受性  72
  4.5 单克隆细胞株间侧群细胞含量差异的分析  72
  4.6 去除杂质细胞方法的分析  72-73
  4.7 侧群细胞的治疗策略  73-74
第五章总结和展望  74-75
  5.1 总结  74
  5.2 展望  74-75
致谢  75-76
参考文献  76-82
附录A 攻读硕士期间发表论文目录  82

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