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腺病毒介导的PAI-2基因对乳腺癌细胞迁移影响的研究

作　者: 沈玮
导　师: 曹祥荣
学　校: 南京师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: PAI-2 乳腺癌 uPA系统 细胞迁移
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


乳腺癌是威胁人类健康乃至生命的重要疾病。在中国,乳腺癌发病的年增长率比世界平均水平高出1%-2%,而我国对于乳腺癌的发病机制及治疗技术的研究仍然相对落后。肿瘤基因治疗一直是肿瘤的生物治疗方法,一般使用的病毒载体是腺病毒,通过对其改造成为增殖型腺病毒,并携带抗癌基因靶向在肿瘤细胞增殖及复制,表达抗癌相关基因并抑杀肿瘤,起到抗癌和溶瘤的双重效果,而对正常细胞影响较小。人纤溶酶原激活剂抑制剂2(PAI-2)是丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员,其在细胞的凋亡和分化、肿瘤的转移中都有重要的作用。因此本研究构建携带双基因人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)调控的腺病毒E1A基因和人纤溶酶原激活剂抑制剂2(PAI-2)基因的增殖型腺病毒载体pAdSu-PAI-2,研究该增殖型腺病毒对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。首先采用同源重组的原理将载体pAdSu-PAI-2与腺病毒骨架质粒相作用,获得重组型腺病毒AdSu-PAI-2, Western结果显示该增殖型腺病毒能够在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达,同时溶圈抑制实验证明重组PAI-2蛋白具有抑制尿激酶的生物活性。细胞划痕实验和Transwell迁移实验均证明该PAI-2基因具有抑制乳腺癌细胞迁移的作用。通过对MAPK信号通路的研究,发现该基因能够下调p38的磷酸化,而对ERK的磷酸化则没有影响。综上说明腺病毒介导表达的重组PAI-2蛋白具有抑制尿激酶的生物学活性,且能抑制乳腺癌细胞的迁移,并且能够通过抑制p38 MAPK信号通路的活性影响细胞的运动能力。尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)系统主要参与细胞外蛋白的溶解和组织修复,在肿瘤转移中也扮演着重要角色。因此本论文还研究了血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对乳腺癌细胞迁移及对uPA系统成员表达的影响,并扩增腺病毒Ad-NRAGE及Ad-RNAi,检测NRAGE基因对uPA系统成员表达的影响。Q-PCR结果显示在MDA-MB-231细胞中AngII能够促进uPA和uPAR的表达,细胞划痕实验证明AngII能促进细胞迁移。通过在细胞中感染病毒Ad-NRAGE或Ad-RNAi,半定量PCR实验表明在MDA-MB-231细胞中NRAGE基因可以抑制uPA和uPAR的表达。以上实验结果表明在MDA-MB-231细胞中AngII能够促进uPA系统成员uPA和uPAR的表达,进而影响细胞的迁移。NRAGE能够抑制uPA和uPAR的表达,但这种影响是一个间接作用。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章 综述  8-17
  第一节 腺病毒载体与PAI-2基因的研究进展  8-13
    1 基因治疗的研究现状  8
    2 腺病毒的研究进展  8-9
    3 增殖型腺病毒的研究进展  9-10
    4 PAI-2的生物学功能  10-13
  第二节 uPA系统、血管紧张素Ⅱ及NRAGE基因的研究进展  13-17
第二章 实验部分  17-43
  第一节 PAI-2基因对乳腺癌细胞迁移的影响  17-29
    1 实验材料  17-19
      1.1 主要药品与试剂  17
      1.2 主要实验仪器  17-18
      1.3 主要试剂配制  18-19
    2 实验方法  19-22
      2.1 重组腺病毒的构建  19
      2.2 Western印迹分析  19-20
      2.3 溶圈抑制法  20-21
      2.4 细胞划痕实验  21
      2.5 Transwell迁移实验  21
      2.6 统计学分析  21-22
    3 实验结果  22-26
      3.1 Western印迹分析  22
      3.2 PAI-2的生物活性鉴定  22-23
      3.3 细胞划痕实验  23-24
      3.4 Transwell迁移实验  24-25
      3.5 PAI-2对MAPK信号通路的影响  25-26
    4 讨论  26-29
  第二节 ANGⅡ和NRAGE对乳腺癌细胞中uPA系统表达影响的研究  29-43
    1 实验材料  29-31
      1.1 主要药品与试剂  29
      1.2 主要实验仪器  29
      1.3 主要试剂配制  29-31
      1.4 所用引物  31
    2 实验方法  31-35
      2.1 Q-PCR检测乳腺癌细胞中uPA系统成员的含量  31-32
      2.2 Q-PCR检测AngⅡ对乳腺癌细胞中uPA系统的影响  32
      2.3 细胞划痕实验  32
      2.4 重组腺病毒的包装及扩增  32-33
      2.5 Western印迹分析  33-34
      2.6 半定量PCR检测NRAGE对乳腺癌细胞中uPA系统成员的影响  34-35
      2.7 统计学分析  35
    3 实验结果  35-41
      3.1 Q-PCR检测乳腺癌细胞中uPA系统成员的含量  35-36
      3.2 Q-PCR检测AngⅡ对乳腺癌细胞中uPA系统的影响  36-37
      3.3 细胞划痕实验  37-40
      3.4 重组腺病毒的包装和扩增  40
      3.5 Western印迹分析  40
      3.6 半定量PCR检测NRAGE对乳腺癌细胞中uPA系统成员的影响  40-41
    4 讨论  41-43
参考文献  43-48
致谢  48

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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