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钳蝎镇痛活性肽（AS）表达产物的体外变复性

作　者: 孙巍
导　师: 张景海
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: AS 表达 体外变复性
分类号: R91
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 6次
引　用: 0次
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内容摘要


通过外源基因在E.coli中的表达来获得蛋白质类药物，已经成为生产基因工程药物的重要手段，如何对包涵体蛋白进行高浓度、高收率的复性，是重组蛋白质生产的关键性技术之一。本文对钳蝎镇痛活性肽(AS)包涵体的重折叠复性进行了研究，以有助于这一问题的解决。首先，将钳蝎镇痛活性肽(AS)的基因克隆到质粒pET28a上，构建表达质粒pET28a-AS，进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析其可溶性，结果表明大部分以包涵体的形式存在，表达量约占菌体总蛋白的31％；将钳蝎镇痛活性肽(AS)的基因克隆到质粒pET28a上，构建表达质粒pET28a-His-AS，进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析其可溶性，结果表明大部分以包涵体的形式存在，表达量约占菌体总蛋白的35％。将含有表达质粒pET28a-AS和表达质粒pET28a-His-AS的菌体蛋白进行超声波破碎，离心后得到包涵体沉淀。分别用Triton X-100和1M的盐酸胍分别洗涤包涵体，包涵体蛋白经8M盐酸胍变性后，采用分步稀释法使变性蛋白的终浓度为0.1mg／ml，复性后得到的蛋白收率分别为22.6％和23.2％。将复性后得到的蛋白进行柱层析分离纯化。含表达质粒pET28a-AS的包涵体蛋白复性后经SP Sepharose Fast Flow层析柱后，SDS-PAGE电泳分析，得到纯度很高的蛋白，Bradford法测蛋白浓度，收率为1.6mg/L发酵液；含表达质粒pET28a-His-AS的包涵体蛋白复性后经镍柱层析柱后，SDS-PAGE电泳分析，得到纯度很高的蛋白，Bradford法测蛋白浓度，最终，收率为1.8mg／L发酵液。

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学
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