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盾壳霉双相发酵过程中污染微生物的分析及其控制

作　者: 尤艳华
导　师: 李国庆
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉双相发酵污染物分离鉴定防治
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]是一种世界性的植物病原真菌,引起很多植物的菌核病。近年来,作物菌核病的生物防治研究引起了国内外许多研究者的重视,。盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的一种重寄生菌,具有防治作物菌核病的潜能,所以,重寄生菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)具有广泛的应用前景。将其应用于生产实践的前提条件是制备大量而且有活性的分生孢子。2009年本实验室张雄硕士采用液-固双相发酵生产盾壳霉(Coniothyrium minitans),筛选出了最优的双相发酵配方和发酵条件,可是在双相发酵过程中存在着污染的问题。本课题主要是以缪华军(2004)诱导的盾壳霉抗农利灵菌株SV-5-2为发酵菌株,采用张雄(2009)年优化的双相发酵配方进行发酵,对其发酵过程中出现的污染真菌和细菌微生物进行分析控制。实验结果如下：在盾壳霉双相发酵过程中分离到7种真菌污染物和10株细菌污染物,对其进行形态学和分子鉴定,鉴定结果为：2种是根霉属(Rhizopus sp.)、2种是木霉属(Trichoderma sp.)、1种是脉胞菌属(Neurospora sp.)、1种是聚端孢(Trichotheciumsp.)、1种是青霉属(Penicillium sp.);7株细菌是芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、2株细菌是沙雷氏菌属(Serratia spp.)、1株细菌范菌属(Pantoea sp.)。连续发酵12个月,总结真菌污染物的发生规律,测真菌污染物对盾壳霉孢子产量的影响。结果显示：真菌污染物随着发酵季节的不同呈现一定的规律：春季发酵,根霉污染最严重,其次是木霉和皮壳青霉；夏季发酵,木霉和根霉污染最严重；秋季发酵,木霉和脉胞菌污染最严重；冬季发酵,脉胞菌污染最严重。深绿木霉、皮壳青霉、粉红复端孢对盾壳霉孢子产量影响最大。测农利灵对7种真菌污染物的EC50。实验结果表明：7种真菌对农利灵比较敏感,EC50最大值为9.68μg a.i./ml。测7种真菌和盾壳霉菌株SV-5-2在4个不同温度下的生长速度,低温下,7种真菌生长速度较慢,高温下生长速度较快,盾壳霉菌株SV-5-2生长速度变化不明显。以这两点为依据,分别采用喷洒农利灵和敞开后低温发酵的方法防治污染的发生,均取得了良好的防治效果。测定细菌对盾壳霉的拮抗作用,结果表明：6株芽孢杆菌对盾壳霉的拮抗作用最大,这6株芽孢杆菌的革兰氏染色均为阳性。陈世忠等人在2000年研究表明：在酒精制浆、糖化过程添加青霉素可以避免染菌,青霉素作为一种抗菌素能抑制产酸细菌生长,对革兰氏阳性菌有较强的抑制及杀灭作用。所以在以后的发酵过程中可以考虑添加适当的抗生素,防治污染的发生。这一部分有待以后进一步研究。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章文献综述  12-23
  1 核盘菌研究进展  12-15
    1.1 核盘菌的寄主范围及危害  12
    1.2 核盘菌的生物学特性  12-13
    1.3 核盘菌的致病机制  13-14
    1.4 作物菌核病的防治  14-15
  2 生防菌盾壳霉研究进展  15-19
    2.1 盾壳霉的生物学特性  15-16
    2.2 盾壳霉的生态学特性  16-17
    2.3 盾壳霉的防病潜力  17-18
    2.4 盾壳霉的规模化生产及制剂的研制  18-19
    2.5 盾壳霉制剂的应用  19
  3 发酵过程中污染的原因及其防控措施  19-22
    3.1 发酵过程中污染途径及污染原因分析  19-20
    3.2 发酵污染的防治措施  20-22
  4 本课题研究的意义  22
  5 本课题研究的内容  22-23
第二章盾壳霉双相发酵过程中真菌污染物的分离及鉴定  23-37
  1 材料与方法  23-29
    1.1 材料  23-24
      1.1.1 供试菌株  23
      1.1.2 供试培养基  23-24
      1.1.3 供试浅盘和锡箔纸  24
      1.1.4 基因组DNA提取相关试剂及配制  24
      1.1.5 PCR扩增的相关试剂  24
    1.2 方法  24-29
      1.2.1 盾壳霉接种体的制备  24-25
      1.2.2 盾壳霉固体接种  25
      1.2.3 真菌污染物的分离  25
      1.2.4 真菌污染物的形态学鉴定  25-26
      1.2.5 真菌污染物的分子鉴定  26-29
        1.2.5.1 真菌污染物DNA的提取及电泳检测  26
        1.2.5.2 真菌污染物的核糖体RNA基因转录间隔区序列(ITS)的PCR扩增  26-27
        1.2.5.3 PCR产物的纯化、回收及序列测定  27-29
  2 结果与分析  29-35
    2.1 真菌污染物的分离  29
    2.2 真菌污染物的形态学鉴定结果  29-35
      2.2.1 米根霉(Rhizopus oryzae)  30-31
      2.2.2 匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)  31
      2.2.3 深绿木霉(Trichoderma atrovirive)  31-32
      2.2.4 绿色木霉(Trichoderma viride)  32-33
      2.2.5 粉红复端孢(Trichothecium roseum)  33
      2.2.6 脉胞菌(Neurospora tetrasperma)  33-34
      2.2.7 皮壳青霉(Penicillium crustosum)  34-35
    2.3 真菌污染物的分子鉴定结果  35
      2.3.1 真菌PCR产物琼脂凝胶电泳  35
      2.3.2 真菌菌株BLAST同源性搜索比较  35
  3 小结  35-37
第三章真菌污染物发生规律及其对盾壳霉孢子产量影响  37-44
  1 材料与方法  37-38
    1.1 材料  37
    1.2 方法  37-38
      1.2.1 总结真菌污染物发生规律  37
      1.2.2 污染物对盾壳霉袍子产量影响的测定  37-38
  2 结果与分析  38-42
    2.1 真菌污染物的发生规律  38-41
      2.1.1 真菌污染物随不同月份的发酵所发生的污染规律  38-39
      2.1.2 四个季度发酵过程中真菌污染物的污染规律  39-41
    2.2 真菌污染物对盾壳霉孢子产量的影响  41-42
  3 讨论  42-44
第四章盾壳霉双相发酵过程中细菌污染物的分离及鉴定  44-55
  1 材料与方法  44-48
    1.1 材料  44-45
      1.1.1 分离所需要的材料  44
      1.1.2 染色试剂  44
      1.1.3 基因组DNA提取相关试剂及配制  44-45
      1.1.4 PCR扩增的相关试剂  45
    1.2 方法  45-48
      1.2.1 细菌污染物的分离  45
      1.2.2 细菌的形态特征观察  45-46
        1.2.2.1 培养形状的观察  45
        1.2.2.2 革兰氏染色  45-46
        1.2.2.3 鞭毛染色  46
        1.2.2.4 芽孢染色  46
      1.2.3 细菌的分子鉴定  46-48
        1.2.3.1 细菌16SrRNA引物的设计与合成  46
        1.2.3.2 细菌基因组的提取  46-47
        1.2.3.3 PCR扩增反应  47-48
        1.2.3.4 PCR产物的纯化、回收及序列测定  48
      1.2.4 细菌污染物对盾壳霉菌丝生长的拮抗作用测定  48
  2 结果与分析  48-54
    2.1 细菌形态特征  48-52
    2.2 细菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳图  52
    2.3 细菌BLAST同源性搜索比较  52
    2.4 细菌对盾壳霉菌丝生长的拮抗作用  52-54
  3 小结  54-55
第五章盾壳霉双相发酵过程中微生物污染的防控  55-65
  1 材料与方法  55-58
    1.1 材料  55-56
      1.1.1 供试菌株  55
      1.1.2 供试培养基  55
      1.1.3 供试固体发酵培养基  55
      1.1.4 供试浅盘和锡箔纸  55-56
      1.1.5 供试杀菌剂  56
    1.2 方法  56-58
      1.2.1 7种真菌污染物对农利灵敏感性的测定  56-57
      1.2.2 温度对7种真菌污染物和盾壳霉菌株SV-5-2生长影响的测定  57
      1.2.3 农药农利灵防治污染的测定  57
      1.2.4 变温发酵对发酵污染的防效测定  57-58
  3 结果与分析  58-63
    3.1 7种真菌污染物对农利灵敏感性的测定结果  58-59
    3.2 温度对7种杂菌和盾壳霉菌株SV-5-2生长影响的测定结果  59-62
    3.3 农药农利灵对污染的防效  62-63
    3.4 低温发酵对污染的防效结果  63
  4 讨论  63-65
参考文献  65-72
致谢  72

盾壳霉双相发酵过程中污染微生物的分析及其控制

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