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双孢蘑菇褐变相关PPO基因的克隆及表达分析

作　者: 罗志姣
导　师: 吴坤；李南羿
学　校: 河南农业大学
专　业: 微生物
关键词: 双孢蘑菇褐变多酚氧化酶基因克隆半定量RT-PCR 原核表达
分类号: S646.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

多酚氧化酶是催化褐变的关键酶,而褐变是双孢蘑菇采后对商品品质影响最大的品质劣变之一。克隆双孢蘑菇褐变相关基因,是实现蘑菇抗褐变定向育种的一项重要的基础研究工作。本研究用双孢蘑菇2796为试样,采用RT-PCR、RACE法克隆了来自于双孢蘑菇子实体褐化相关的PPO基因,并使其在大肠杆菌中做表达。对其基因进行同源性比较和序列分析。论文包括了三部分实验：(1)双孢蘑菇多酚氧化酶PPO基因的克隆及氨基酸序列测定：设计codehop引物克隆了PPO基因cDNA片段,并根据获得的序列信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)方法从双孢蘑菇中克隆到了两个PPO同源基因的cDNA全长,将其命名为AbPPO3和AbPPO4,核酸长度分别为1.88kb和2.023kb,分别编码576和611个氨基酸,具有多酚氧化酶的Cu结合保守结构域。同源性分析表明,AbPPO3编码的氨基酸序列与其他真菌PPO同源蛋白的相似性约为21.50%；AbPPO4与其他真菌PPO蛋白的相似性约为20-63%。系统进化分析表明,AbPPO3和AbPPO4和已克隆的双孢蘑菇AbPPO2具有较近的进化关系。(2)多酚氧化酶基因表达的半定量RT-PCR分析：用半定量RT-PCR法,以18s rRNA基因作为内参照,研究双孢蘑菇褐变相关基因PPO mRNA的表达水平。分析结果表明,在双孢蘑菇子实体的不同发育时期,AbPPO3在针头期(pin head stage)表达量很低,在茶杯期(cup stage)至大开伞期(flat2 stage)表达量均较高。AbPPO4在针头期(pin head stage)到大开伞期(flat2 stage)表达量逐渐增强。双孢蘑菇4℃储藏时,AbPPO3和AbPPO4在第1天可检测到微量表达,第2～4天表达均较强,之后至第7天表达量下降。(3)多酚氧化酶PPO基因在大肠杆菌中的表达：将PPO构建到pET28a(+)上,转入E.coli BL21 (DE3)获得重组菌株,使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导PPO蛋白的表达,应用SDS-PAGE分析目的蛋白,得到了分子量约为67KDa的特异表达条带,与表达产物的理论值相符。

全文目录

致谢  4-7
摘要  7-8
1 文献综述  8-17
  1.1 双孢蘑菇  8-9
  1.2 双孢蘑菇褐变研究进展  9-10
    1.2.1 褐变机理  9
    1.2.2 褐变因素  9-10
  1.3 多酚氧化酶研究进展  10-14
    1.3.1 多酚氧化酶概述  10
    1.3.2 多酚氧化酶催化的反应及其作用  10-12
    1.3.3 多酚氧化酶基因的特点  12-13
    1.3.4 多酚氧化酶的结构与功能  13-14
  1.4 常用外源表达系统  14-15
  1.5 多酚氧化酶研究发展前景  15-17
2 引言  17-18
3 材料与方法  18-29
  3.1 材料  18
    3.1.1 菌株和载体  18
    3.1.2 药品与试剂  18
    3.1.3 培养基  18
    3.1.4 仪器设备  18
  3.2 流程  18-20
    3.2.1 双孢蘑菇PPO基因的克隆  18-19
    3.2.2 双孢蘑菇PPO基因在大肠杆菌中的表达  19-20
  3.3 方法  20-29
    3.3.1 总RNA的提取  20-21
    3.3.2 RT-PCR  21-26
      3.3.2.1 PCR扩增PPO保守区的cDNA  21-22
      3.3.2.2 3'-RACE和5'-RACE的PCR扩增  22-25
      3.3.2.3 PPO全长cDNA的扩增  25-26
      3.3.2.4 扩增产物的克隆及测序  26
      3.3.2.5 序列分析及同源性比较  26
    3.3.3 双孢蘑菇PPO基因的半定量RT-PCR  26-27
    3.3.4 重组载体的构建  27
    3.3.5 大肠杆菌阳性转化子的获得  27
    3.3.6 目的基因在大肠杆菌中的表达检测  27-29
4 结果与分析  29-42
  4.1 多酚氧化酶基因的克隆  29-35
    4.1.1 双孢蘑菇总RNA提取  29
    4.1.2 双孢蘑菇PPO基因的克隆  29-35
      4.1.2.1 双孢蘑菇PPO保守区cDNA的PCR扩增  29
      4.1.2.2 双孢蘑菇PPO保守区cDNA的测序  29-31
      4.1.2.3 双孢蘑菇PPO cDNA的3'-RACE和5'-RACE  31
      4.1.2.4 双孢蘑菇PPO全长cDNA的扩增  31-32
      4.1.2.5 双孢蘑菇PPO全长cDNA序列的测定  32-35
  4.2 双孢蘑菇PPO序列同源性及进化树分析  35-39
  4.3 双孢蘑菇PPO基因的半定量分析  39
  4.4 双孢蘑菇PPO基因在大肠杆菌中的表达  39-42
5 结论与讨论  42-44
  5.1 结论  42
  5.2 讨论  42-44
参考文献  44-50
ABSTRACT  50-51

双孢蘑菇褐变相关PPO基因的克隆及表达分析

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