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狗枣猕猴桃多酚的抗氧化与抗肿瘤效应研究

作　者: 左丽丽
导　师: 王振宇
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 狗枣猕猴桃多酚自由基氧化损伤抗肿瘤活性
分类号: TS201.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

现代医学研究表明自由基具有强氧化性，攻击生物大分子，损害机体的组织和细胞，导致癌症、炎症、心脏病、心血管疾病、糖尿病等近百种疾病的发生，因此评价和筛选具有抗氧化功能的天然抗氧化物已经成为现代生命科学研究的热点问题。本文以猕猴桃多酚为研究对象，采用活性跟踪方法，获得活性最强的狗枣猕猴桃多酚，并进行组成成分分析。系统地分析了狗枣猕猴桃多酚的体外抗氧化活性及抗恶性肿瘤增殖活性，并对其体内氧化损伤的防护作用以及体内抗肿瘤作用进行了相关性分析。系统地分析了猕猴桃多酚的体外抗氧化和抗恶性肿瘤增殖活性。通过总还原能力、清除生理性自由基（羟基自由基、超氧自由基）、非生理性自由基（ABTS、DPPH）、抗脂质过氧化能力分析，发现狗枣猕猴桃具有最低的IC50值，其抗氧化能力最强，其次是软枣猕猴桃、中华猕猴桃，并发现其抗氧化能力与总多酚含量之间具有很好的相关性，相关系数大于0.7。研究了三种猕猴桃多酚抑制HepG2、HT-29、HeLa以及A549细胞的增殖活性，结果表明三种猕猴桃多酚均具有较好的抑制HepG2、HT-29、HeLa和A549等四种肿瘤细胞增殖的能力。采用活性跟踪的方法分离纯化狗枣猕猴桃多酚。首先使用60%的乙醇辅助超声波的方法对三种猕猴桃多酚进行提取，通过旋转蒸发仪浓缩样品，采用福林酚法测定总多酚含量，结果发现狗枣猕猴桃提取物中具有最高的总多酚含量，达到430.03±21.85mgGAE/100g鲜果。采用多通道二维色谱纯化狗枣猕猴桃多酚，通过单因素实验和响应面分析优化最佳的纯化条件，得最佳纯化条件为：上样量57.27mL，洗脱浓度71.71%，洗脱2.85个柱体积，在此条件下，响应面预测结果获得的总酚含量为11.99mg/mL，与实测结果差异不显著。纯化的狗枣猕猴桃多酚复合物（AKP）通过HPLC-ESI-MS液质联用技术进行分析，发现其中含有香豆酸、香草酸、绿原酸、山奈酚、儿茶素、白藜芦醇、对香豆酸、异鼠李素3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-己糖苷、槲皮素-鼠李糖苷等成分。使用⁶⁰Co γ射线诱导小鼠建立氧化损伤模型。实验结果表明，AKP通过促进造血功能、增加脾细胞的增殖、并刺激白介素IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的产生，提高机体的免疫力，显著的降低了辐射对机体造成的伤害。同时还激活体内抗氧化酶系统，增加了体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），抑制脂质过氧化反应的发生，降低体内丙二醛（MDA）的水平，提高非酶系统抗氧化物质谷胱甘肽（GSH）的含量，抵抗机体在氧化损伤过程中产生的过量自由基。结果表AKP在激活体内抗氧化物酶系统的同时，抑制氧化酶系的活性，降低脂质过氧化反应的发生，有效的保护细胞的完整性，降低骨髓微核率和染色体畸变的产生，进一步验证了AKP对辐射诱导的氧化损伤的防护作用。使用S180实体瘤接种小鼠建立恶性肿瘤模型，结果表明AKP能够显著提高了肿瘤小鼠的存活时间，低、中、高剂量组对S180实体瘤的抑制率分别为20.91%，38.17%和44.27%，同时药物通过促进脾淋巴细胞的增殖，显著提高脾脏指数和胸腺指数，进一步提高机体的免疫力。机体免疫系统能够有效的识别肿瘤细胞并发生应答，从而达到抗肿瘤的目的。通过DNALadder实验发现AKP能够显著的诱导HepG2、HeLa细胞凋亡，表现出特征性的梯度条带。进一步通过细胞周期分析发现AKP能够阻滞HepG2细胞在G2/M期，而阻滞HeLa细胞在G0/G1期，使癌细胞增殖速度减慢，从而诱导细胞凋亡。这表明AKP能够通过多种途径诱导细胞的凋亡，达到抑制癌细胞增殖的目的。建立了AKP抗氧化和抗恶性肿瘤增殖活性之间的相关性，揭示了多酚类化合物的抗氧化活性与清除活性氧自由基以及防癌抑癌作用之间存在密切的关系。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-16
第1章绪论  16-36
  1.1 课题背景及研究的目的意义  16-17
  1.2 猕猴桃属植物研究现状  17-20
    1.2.1 猕猴桃中化学成分研究概况  17-18
    1.2.2 猕猴桃中活性成分的生理功能  18-20
  1.3 多酚类化合物研究概况  20-30
    1.3.1 多酚类化合物的结构和分类  20-21
    1.3.2 多酚类化合物的理化性质  21-22
    1.3.3 多酚类化合物的生理功能  22-26
    1.3.4 多酚类化合物的提取方法  26-28
    1.3.5 多酚类化合物纯化方法  28-29
    1.3.6 多酚类化合物的应用  29-30
  1.4 氧化诱导的损伤机制及防护机制  30-34
    1.4.1 自由基及其产生  30
    1.4.2 抗氧化剂对自由基造成生物大分子损伤的防护作用  30-31
    1.4.3 多酚类化合物的抗氧化途径  31-32
    1.4.4 多酚类化合物的抗肿瘤及其作用途径  32-33
    1.4.5 多酚类化合物抗氧化和抗肿瘤活性之间的相关性  33-34
  1.5 本文的主要研究内容和技术路线  34-36
    1.5.1 本文的研究内容  34-35
    1.5.2 本文的技术路线  35-36
第2章实验材料与研究方法  36-52
  2.1 实验材料与仪器  36-38
    2.1.1 实验材料  36
    2.1.2 试剂及药品  36-37
    2.1.3 仪器设备  37-38
  2.2 三种猕猴桃多酚提取方法  38
  2.3 三种猕猴桃总多酚含量测定  38-39
  2.4 狗枣猕猴桃多酚纯化工艺条件优化  39-40
    2.4.1 AB-8 大孔树脂的预处理  39
    2.4.2 单因素实验  39
    2.4.3 狗枣猕猴桃多酚纯化工艺响应面实验  39-40
  2.5 高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS）分析 AKP 中多酚组成  40
  2.6 猕猴桃多酚抗氧化能力的分析  40-43
    2.6.1 猕猴桃多酚总还原能力的测定  40
    2.6.2 猕猴桃多酚清除自由基能力的测定  40-42
    2.6.3 猕猴桃多酚对脂质过氧化抑制能力的测定  42
    2.6.4 体内相关抗氧化酶活力的测定  42-43
  2.7 狗枣猕猴桃多酚对辐射诱导损伤的防护作用研究  43-47
    2.7.1 小鼠辐射损伤模型的建立  43-44
    2.7.2 ~(60)Coγ射线对机体 DNA 造成的损伤  44-45
    2.7.3 ~(60)Coγ射线对机体免疫系统的影响  45-47
  2.8 猕猴桃多酚抗肿瘤活性的分析  47-51
    2.8.1 溶液配制  47-48
    2.8.2 肿瘤细胞的培养及方法  48-49
    2.8.3 MTT 法检测细胞增殖抑制率  49
    2.8.4 DNA Ladder 检测方法  49
    2.8.5 肿瘤细胞周期测定方法  49-50
    2.8.6 小鼠肿瘤模型的建立  50
    2.8.7 实验分组及灌胃方法  50-51
    2.8.8 荷瘤小鼠免疫指数测定  51
    2.8.9 狗枣猕猴桃多酚对 S180 实体瘤的抑制率  51
  2.9 数据的处理及统计分析  51-52
第3章猕猴桃多酚类抗氧化能力及生物有效性筛选  52-63
  3.1 引言  52
  3.2 猕猴桃多酚的抗氧化活性分析  52-58
    3.2.1 猕猴桃多酚总还原能力的分析  52-53
    3.2.2 猕猴桃多酚对自由基的清除能力  53-57
    3.2.3 猕猴桃多酚抑制脂质过氧化反应  57-58
  3.3 猕猴桃多酚对肿瘤细胞增殖的抑制作用  58-62
    3.3.1 猕猴桃多酚对肿瘤细胞形态的影响  59-60
    3.3.2 猕猴桃多酚对肿瘤细胞增殖活性的影响  60-62
  3.4 本章小结  62-63
第4章狗枣猕猴桃多酚分离鉴定  63-76
  4.1 引言  63
  4.2 猕猴桃提取物中总酚含量的分析  63-65
  4.3 狗枣猕猴桃多酚分离工艺优化  65-71
    4.3.1 狗枣猕猴桃多酚纯化单因素实验  65-67
    4.3.2 响应面法（RSM）优化洗脱条件  67-69
    4.3.3 响应面法分析与优化  69-71
  4.4 高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）鉴定狗枣猕猴桃多酚  71-75
  4.5 本章小结  75-76
第5章狗枣猕猴桃多酚复合物对辐射诱导机体氧化损伤的防护作用研究  76-102
  5.1 引言  76-77
  5.2 辐射模型的建立  77-80
    5.2.1 一般情况  77
    5.2.2 ~(60)Coγ射线对小鼠体重的影响  77
    5.2.3 ~(60)Coγ射线对 MDA 含量的影响  77-78
    5.2.4 ~(60)Co γ射线对造血及免疫系统的影响  78-79
    5.2.5 ~(60)Coγ射线对机体 DNA 的影响  79-80
  5.3 AKP 对小鼠氧化损伤模型的防护作用  80-101
    5.3.1 AKP 对小鼠体重的影响  80-81
    5.3.2 AKP 对造血及免疫系统的防护作用  81-90
    5.3.3 AKP 对体内 MDA 及相关抗氧化酶活力的影响  90-98
    5.3.4 AKP 对细胞 DNA 的防护作用  98-101
  5.4 本章小结  101-102
第6章狗枣猕猴桃多酚抗肿瘤作用及相关性分析  102-121
  6.1 引言  102-103
  6.2 AKP 诱导肿瘤细胞凋亡的研究  103-104
  6.3 AKP 对肿瘤细胞周期的抑制作用  104-110
  6.4 AKP 体内抗肿瘤作用研究  110-115
    6.4.1 AKP 对肿瘤细胞增殖的抑制能力  110-114
    6.4.2 AKP 对荷瘤鼠免疫器官功能的影响  114-115
  6.5 相关性分析  115-120
    6.5.1 AKP 体外抗氧化能力与抗癌活性之间的相关性  115-118
    6.5.2 AKP 促进脾淋巴细胞增殖与对小鼠实体瘤抑制率的相关性分析  118-119
    6.5.3 AKP 促进脾指数与对小鼠实体瘤抑制率的相关性分析  119
    6.5.4 AKP 促进胸腺指数与对小鼠实体瘤抑制率的相关性分析  119-120
  6.6 本章小结  120-121
结论  121-124
参考文献  124-141
附录  141-147
攻读博士学位期间发表的论文及其它成果  147-150
致谢  150-151
个人简历  151

狗枣猕猴桃多酚的抗氧化与抗肿瘤效应研究

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