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大鼠心肌缺血模型和清醒遥测模型的建立及其在药物评价中的应用

作　者: 袁海涛
导　师: 彭双清
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 卫生毒理学
关键词: 心肌缺血心肌缺血再灌注损伤清醒遥测动物安全药理学动物模型
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

心血管系统是人体最重要的系统之一,其主要生理功能是通过血液循环来维持机体内环境的稳定。随着工业化的进程,不良生活方式和有害环境因素的影响,心血管疾病,如冠心病、高血压、脑卒中、充血性心力衰竭和周围血管病已经成为影响西方发达国家发病率和死亡率的首要因素,其中冠心病是引起心血管疾病死亡的首要原因;在中国,心血管疾病在总死亡率中仅次于恶性肿瘤,居于第二位,其中缺血性心脏病的死亡率居于所有心血管疾病的首位。故抗心肌缺血类药物的研发已经成为药物研发的热点。建立合适的动物模型,一方面可以为了解心肌缺血性疾病的发病机制和病理生理学改变提供重要的信息;更重要的是可以为新药研发中药物的药效学评价提供有效的工具,筛选有治疗作用的化合物,从而促进新药的开发,为临床治疗心血管疾病提供有效的治疗药物。常用的心肌缺血动物模型主要通过两种方法来制备,一种是通过药物法,给予能增加实验动物心肌耗氧量或减少心脏血液供应的药物,造成心肌缺血;另一种方法是通过开胸手术,结扎实验动物的冠状动脉,造成心肌缺血。在本研究第一部分,通过制备垂体后叶素致大鼠心肌缺血模型评价黄杨宁(CVB-D)和黄杨宁新化合物(CVB-D1)的抗心肌缺血作用;通过开胸手术,建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,并应用该模型从心脏功能、抗心律失常、脂质过氧化水平和抗心肌梗死四个方面评价黄杨宁抗心肌缺血再灌注损伤的作用。化合物的有效性是药物研发中需考虑的首要因素,但安全性也是化合物成为药物必不可少的前提条件之一。动物模型可以为新化合物实体首次暴露于人体之前提供许多关于有效性和安全性的信息。心血管药物药理毒理学研究既可以使用清醒动物模型也可以使用麻醉动物模型,传统的毒理学和药理学研究都是使用麻醉动物模型实施的。麻醉动物模型作为药理毒理学经典的研究手段,具有可在避免动物疼痛和应激的状态下直接测得心血管的参数,并且在实验动物麻醉期间可获得相对稳定的基线数据的优势。随着技术和工艺的改进,以及一系列安全药理学研究指导原则的颁布,应用清醒动物模型进行药物的安全性评价研究变得越来越普及,与传统的麻醉或束缚动物相比,清醒动物模型可在动物清醒状态下连续、动态监测各项生理参数,不受麻醉或束缚的干扰;且可减少动物用量,更为符合动物福利(3R)原则。ICH (人用药品注册技术要求国际协调会)2000年和2005年推荐采纳的S7A(人用药物安全药理学研究指导原则)和S7B(人用药延迟心室复极化潜在作用的非临床评价指导原则)在体内研究中推荐采用清醒动物。本部分研究应用植入式遥测系统,建立了可在清醒状态下连续、动态长期监测心血管参数的大鼠遥测模型,并应用该遥测大鼠模型评价了AF114注射液对心血管系统的安全性。第一部分应用大鼠心肌缺血模型评价黄杨宁的抗心肌缺血作用本部分实验采用垂体后叶素致大鼠心肌缺血模型评价CVB-D和CVB-D1的抗心肌缺血作用;采用麻醉大鼠心肌缺血再灌损伤注模型评价CVB-D抗心肌缺血再灌注损伤的药效学作用。将24只SD大鼠随机均分为4组:对照组(Control,给予等体积的生理盐水)、模型组(model,给予0.5 u/kg垂体后叶素和相应体积的生理盐水)、黄杨宁组(CVB-D,给予0.5 u/kg垂体后叶素和0.5 mg/kg CVB-D)、黄杨宁新化合物组(CVB-D1,给予0.5 u/kg垂体后叶素和0.5 mg/kg CVB-D1),每组6只动物,记录给药后的平均动脉压、心率和心电图T波的变化。CVB-D和CVB-D1对垂体后叶素引起的平均动脉压升高无作用;两者均可对抗垂体后叶素引起的心率下降,CVB-D的作用比CVB-D1更持久;CVB-D在第5min、7min、9min和11min可明显对抗垂体后叶素引起大鼠心电图T波的低平,与模型组相比差异显著(p<0.05);CVB-D 1在第7min、9min和11min能对抗垂体后叶素引起大鼠心电图T波的低平,与模型组相比差异显著(p<0.05)。通过开胸手术结扎冠状动脉前降支30min,再灌注2h建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。将24只SD大鼠随机均分为4组:模型组、CVB-D 1mg/kg组、CVB-D 2mg/kg组、CVB-D 4mg/kg组,每组6只动物,在结扎冠状动脉前,分别经股静脉给予各组实验大鼠相应剂量的CVB-D和等体积的生理盐水预处理,实验过程中连续监测血压、心室内压、心率和心电图等参数,实验结束后取大鼠血清检测脂质过氧化产物MDA含量,取心脏伊文思蓝-TTC染色,计算心肌梗死面积。实验结果表明,CVB-D 2mg/kg组和CVB-D 4mg/kg组在再灌注2h时,能明显升高缺血再灌注大鼠的平均动脉压,与对照组相比差异显著(p<0.05);与对照组相比,CVB-D 2mg/kg组在再灌注2h时心率明显降低,CVB-D 4mg/kg组在再灌注1h、2h两个时间点也能使大鼠心率明显降低(p<0.05);CVB-D4mg/kg组的+dp/dtmax在再灌注2h高于对照组,提示CVB-D在该剂量可使左心室+dp/dtmax增加,增强心肌收缩力; CVB-D 2mg/kg组和CVB-D 4mg/kg组与对照组相比, -dp/dtmax在再灌注2h明显减小,提示CVB-D在该剂量时可改善心肌缺血再灌注后心脏的舒张功能。与对照组相比,CVB-D 4mg/kg在缺血再灌注2h时,使LVDP明显升高(p<0.05),提示在该剂量下,CVB-D具有增强心肌缺血再灌注大鼠心脏收缩功能的作用;CVB-D 4mg/kg组的压力-心率指数(PRI)在心肌再灌注30min,1h,2h明显低于对照组(p<0.05),提示在该剂量水平,CVB-D具有降低心肌的需氧量的作用;与对照组相比,CVB-D 2mg/kg组和CVB-D 4mg/kg能明显减少心律失常的得分,差异显著(p<0.05);CVB-D 4mg/kg组血清中MDA的含量明显低于对照组血清中MDA的含量(p<0.05);与对照组比较,CVB-D 2mg/kg和CVB-D 4mg/kg能明显减小心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死面积(p<0.05)。综合本部分研究结果,可得到以下结论:①本部分研究成功的建立了垂体后叶素致大鼠心肌缺血模型和心肌缺血再灌注损伤模型;②CVB-D和改构化合物CVB-D1均具有对抗垂体后叶素引起的大鼠心电图T波低平,提示CVB-D和CVB-D1具有对抗心肌缺血的作用,但CVB-D的抗心肌缺血作用比CVB-D1更持久。③CVB-D可通过改善心脏的收缩舒张功能,降低缺血再灌注后血清中脂质过氧化产物MDA的水平,降低心肌缺血再灌注后心律失常的发生频率,减小心肌梗死面积等作用,来减轻心肌缺血再灌注损伤。第二部分应用清醒大鼠遥测模型评价AF114注射液的心血管系统安全性本部分研究应用植入式生理信号遥测系统,通过手术建立了可在清醒自由活动状态下长期监测心血管系统参数和体温变化的大鼠遥测模型,并评价AF114注射液对心血管系统及体温的影响。通过手术,将植入体(DSI, TL11M2-C50-PXT)的压力导管插入大鼠腹主动脉,止血后用组织胶粘合穿刺点;将心电图正负电极引出腹腔,正极放置于剑突左侧和肋骨腔底部之间的位置,负极放置于右肩的位置,监测Ⅱ导联心电图;并经颈静脉置入导管,经皮下穿刺将导管从颈后侧引出,固定后用于给药或采血。手术后连续监测大鼠血压、心率、体温、摄食量16d,以此评估手术后动物的恢复情况;监测结果显示,手术后4-5d,手术动物的血压、心率和体温恢复昼夜节律性,摄食量趋于稳定,故将7d定为手术大鼠的恢复期;本实验选用垂体后叶素作为阳性药物,将术后恢复7d的9只遥测大鼠随机分为阳性药物组(n=6)和生理盐水对照组(n=3),分别经腹腔注射给给予1u/kg体重的垂体后叶素和等体积的生理盐水,给药量为1ml/kg体重,连续监测给予垂体后叶素和生理盐水前后遥测大鼠心血管系统各参数和体温的变化,评价大鼠遥测模型对阳性药物垂体后叶素的反应性。模型验证后用该模型评价AF114注射液对心血管系统参数及体温的影响,20只雄性大鼠分4批完成实验,每次将手术成功的5只动物随机分为高剂量组、中剂量组、低剂量组和生理盐水组,分别经颈部导管给予AF114注射液9 ml/kg、4.5 ml/kg、2.25ml/kg和生理盐水9ml/kg,连续记录给药后血压、心率、体温和心电图等参数20h。实验结束后经颈部导管采集0.2ml血液,测定血小板计数和红细胞计数。结果表明,植入手术后,32只大鼠手术后29只恢复良好,无感染,均可监测到腹主动脉血压、心电图、体温等生理信号,手术成功率为91%。遥测大鼠平均动脉压和心率术后4-5d恢复昼夜节律,体温3-4d恢复昼夜节律,摄食量于手术后5d趋于稳定,故将7d定为大鼠术后的恢复期,即手术后7d的遥测大鼠可用于实验。经腹腔注射给予清醒大鼠1u/kg体重垂体后叶素后,可观察到平均动脉压升高,射血时间延长,体温降低,心率减慢,TTPK延长等一系列变化,说明该模型对阳性药物反应敏感,模型建立成功。经静脉给予AF114注射液后,引起大鼠平均动脉压升高,心率加快,体温升高,血小板计数和红细胞计数无明显影响。综合本部分研究结果,可得到以下结论:①本研究成功建立了清醒大鼠心血管遥测模型,植入手术后7d后的遥测大鼠可用于实验,遥测大鼠对阳性药物垂体后叶素反应敏感。②静脉注射AF114注射液后可引发清醒大鼠急性瞬时反应(血压升高、心率加快)和延长的发热反应(体温升高)。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-14
前言  14-16
第一部分应用大鼠心肌缺血模型评价黄杨宁的抗心肌缺血作用  16-40
  CVB-D 和CVB-D1 对垂体后叶素致心肌缺血大鼠模型的作用  18-23
    实验材料  18-19
    实验方法  19-20
    实验结果  20-23
  CVB-D 抗心肌缺血再灌注损伤作用  23-37
    实验材料  23-24
    模型建立  24-25
    实验方法  25-30
    实验结果  30-37
  讨论  37-40
第二部分应用清醒大鼠遥测模型评价AF114 注射液的心血管系统的安全性  40-59
  试验材料  40-42
  模型建立及验证  42-45
  AF114 注射液对心血管系统的安全性评价  45-46
  实验结果  46-56
  讨论  56-59
结论  59-60
参考文献  60-64
文献综述  64-74
  Reference  71-74
个人简历  74-75
致谢  75

大鼠心肌缺血模型和清醒遥测模型的建立及其在药物评价中的应用

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