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溶栓药物瑞替普酶（rPA）的大肠杆菌表达研究

作　者: 田文静
导　师: 张同存
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 瑞替普酶 rPA DsbC 乳糖大肠杆菌表达
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

瑞替普酶(Reteplase, rPA)是组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator, t-PA)的突变体,它能高效特异地与血栓中的纤维蛋白结合,产生的rPA-纤维蛋白复合物能高效特异性地激活血凝块中的纤溶酶原,产生纤溶酶,使纤维蛋白降解成可溶性产物,达到血块溶解,栓塞的血管重新畅通的目的。通过PCR扩增得到rPA的基因片断,将该基因片断克隆到载体pET40b中,构建得到pET40b-rPA重组质粒。在载体pET40b中有二硫键异构酶DsbC,它是大肠杆菌重要的二硫键合成酶之一,可以显著提高重组蛋白质二硫键的正确形成并实现其可溶性表达。经双酶切及测序结果证明得到正确的重组质粒之后,转化到大肠杆菌BL21中进行诱导表达。分别用IPTG和乳糖对重组质粒进行诱导表达,在诱导浓度、诱导持续时间、温度等参数上确定了最佳诱导条件,并对IPTG和乳糖最佳诱导条件进行了比较。利用乳糖作为诱导剂可以起到很好的诱导表达效果,诱导产物的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近,同时乳糖所具备的无毒和价廉的优点,使得其在重组蛋白的大规模发酵生产中,具有优于IPTG的潜在价值和优势。用BCA蛋白定量法计算得到在上清中的可溶性目的蛋白的含量占总蛋白量的40%。诱导表达获得重组目的蛋白,超声破碎后上清用镍柱亲和层析纯化。用镍柱法纯化的融合蛋白脱盐后,接着用Xa因子切割,得到了rPA蛋白。利用纤维蛋白平板法对纯化后表达产物的溶栓活性进行了检测。结果显示：经纯化后的目的蛋白可表现出明显的溶栓活性。本课题旨在用原核表达的方法筛选高表达rPA的基因工程菌株,为对其进一步的研究开发工作奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 前言  9-25
  1.1 血栓及溶栓药物概述  9-11
    1.1.1 纤溶系统和血栓形成  9-10
    1.1.2 溶栓药物的研究进展  10-11
  1.2 组织纤维蛋白酶原激活剂(tPA)  11-13
    1.2.1 tPA的分子结构  11-12
    1.2.2 tPA的作用机制  12-13
  1.3 组织型纤溶酶原激活剂tPA突变体  13-15
    1.3.1 Reteplase (rPA)  13-15
    1.3.2 Tenecteplase (TNK-tPA)  15
    1.3.3 Monteplase  15
    1.3.4 Lanoteplase(nPA)  15
    1.3.5 K1K2Pu嵌合体  15
  1.4 tPA及其突变体表达系统的开发  15-19
    1.4.1 大肠杆菌表达系统  16
    1.4.2 酵母菌表达系统  16-17
    1.4.3 丝状真菌表达系统  17
    1.4.4 昆虫细胞表达系统  17-18
    1.4.5 植物细胞表达系统  18
    1.4.6 哺乳动物细胞表达系统  18-19
  1.5 选择大肠杆菌作为高效表达体系表达rPA  19-20
  1.6 镍柱对带有His-Tag标签蛋白的纯化  20-22
    1.6.1 IMAC简介  20
    1.6.2 影响IMAC纯化结果的因素  20-22
  1.7 立题依据  22-23
  1.8 设计框架  23-25
2 材料与方法  25-37
  2.1 材料  25-29
    2.1.1 细胞与菌株  25
    2.1.2 质粒  25
    2.1.3 引物  25-26
    2.1.4 试剂  26
    2.1.5 工具酶及试剂盒  26-27
    2.1.6 主要设备  27-28
    2.1.7 抗生素  28
    2.1.8 培养基  28
    2.1.9 主要溶液  28-29
  2.2 方法  29-37
    2.2.1 质粒的小量制备  29-30
    2.2.2 PCR反应  30
    2.2.3 琼脂糖凝胶电泳  30-31
    2.2.4 切胶回收  31
    2.2.5 双酶切反应  31-32
    2.2.6 连接反应  32
    2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备  32-33
    2.2.8 转化E.coli DH5α  33
    2.2.9 基因测序  33
    2.2.10 重组子转化E.coli BL21  33
    2.2.11 IPTG最佳诱导条件的确定,,并与乳糖最佳诱导条件进行比较  33-34
    2.2.12 BCA法蛋白定量  34
    2.2.13 镍柱法纯化融合蛋白  34-35
    2.2.14 Xa因子切割融合蛋白  35
    2.2.15 蛋白质凝胶电泳分析  35-36
    2.2.16 纤维蛋白平板法验证产物活性  36-37
3 结果与讨论  37-53
  3.1 tPA质粒的提取  37
  3.2 PCR扩增rPA片段  37-39
  3.3 pET40b-rPA质粒的构建  39-41
  3.4 IPTG最佳诱导表达条件的确定  41-44
    3.4.1 IPTG诱导表达浓度的优化  41-42
    3.4.2 IPTG诱导蛋白表达最佳时间的确定  42-43
    3.4.3 IPTG诱导蛋白表达最佳温度的确定  43-44
  3.5 乳糖最佳诱导表达条件的确定  44-46
    3.5.1 乳糖诱导蛋白表达最佳浓度的确定  44-45
    3.5.2 乳糖诱导蛋白表达持续时问的确定  45-46
    3.5.3 乳糖诱导蛋白表达温度的确定  46
  3.6 IPTG和乳糖最佳诱导表达条件的比较  46-47
  3.7 镍柱法纯化融合蛋白  47-50
  3.8 Xa因子切割融合蛋白  50-51
  3.9 纤维蛋白平板法验证产物活性  51-53
4 结论  53-54
5 展望  54-55
6 参考文献  55-61
7 论文发表情况  61-62
8 致谢  62

溶栓药物瑞替普酶（rPA）的大肠杆菌表达研究

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