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肝素寡糖抑制β淀粉样蛋白细胞毒性的结构关系研究

作　者: 孙小婷
导　师: 靳岚; 凌沛学
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 肝素寡糖 β淀粉样蛋白细胞毒性 MTT 圆二色谱
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本课题旨在研究肝素寡糖与淀粉样蛋白Aβ的相互作用对Ap细胞毒性的影响,主要研究内容包括肝素寡糖的制备和分离纯化、肝素寡糖对Ap引起神经细胞损伤的预保护及修复作用,以及采用圆二色谱法检测四种肝素寡糖对Ap构象变化的影响。肝素是一种由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸交替组成的直链糖胺聚糖。制剂分子量为1200-40000,是一种酸性黏多糖,主要由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生。肝素作为一种糖胺聚糖化合物,除了经典的抗凝血及其相关的抗血栓生成活性以外,还具有免疫调节、抗平滑肌细胞增生、调节多肽生长因子、抑制细胞增殖、抗炎、抗肿瘤转移等多种生物学活性和药理作用。肝素寡糖是由不同降解方法降解获得的寡糖片段,平均分子量约为1000-4000,不同降解方法获得的肝素寡糖因其单糖组成结构的差异性而具有不同的生物学功能。阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease, AD)作为老年痴呆症的主要病因,正日益成为一个随着人口老龄化发展不断加剧的问题。其主要的病理机制是淀粉样蛋白Ap和Tau蛋白的构象改变。正常情况下,两者在体内正常表达,而在病理条件下,两种蛋白会进行自我组装成为有毒的β-折叠结构。AD的主要病理组织学特点是老年斑和神经元纤维缠结,其中老年斑主要由淀粉样蛋白Aβ细胞外沉积产生,而神经元纤维缠结主要是由过度磷酸化的Tau蛋白在细胞内聚集产生。鉴于Aβ在AD病理机制中的关键作用,过去十年中的研究主要侧重于淀粉样蛋白Ap的产生、聚集、清除和毒性作用方面。AD的发病机制十分复杂,其中Ap的沉积被认为是诱发AD发生和发展的关键因素。AD的发病过程也伴随着一系列的炎症反应,越来越多的证据表明这些炎症反应可以引起大脑功能和神经元细胞发生不可逆转的变化。AD病理过程的复杂性为治疗干预提供了大量的潜在目标。那些可以直接与Aβ蛋白发生作用或者可以干预Aβ蛋白产生或聚集的化合物可以减轻炎症反应,削弱Aβ蛋白的神经毒性。本课题以Aβ为研究靶点,探讨了四种肝素寡糖对Aβ引起神经细胞损伤的预保护及修复作用,并在分子水平上进一步研究了四种肝素寡糖对Aβ构象变化的影响。1肝素寡糖的制备及分离纯化通过HPLC对酶解条件进行了优化,确立了肝素酶解的最适条件如下：肝素：100mg肝素酶溶液：100ul(1IU)醋酸钠溶液(0.1M,pH=7.0)：10ml醋酸钙溶液(0.01M)：1500ul反应温度：35℃采用Bio-gel P10和G-10柱对酶解产物进行分离纯化,从而获得单一聚合度的寡糖组分。并通过质谱分析和PAGE电泳确定分离纯化获得的样品成份分别为肝素四糖、六糖、八糖和十糖。2肝素寡糖对Aβ引起神经细胞损伤的预保护和修复作用采用MTT法观察了四种肝素寡糖对Aβ引起神经母细胞瘤SH-SY5Y及(褐家鼠)肾上腺嗜铬细胞瘤PC12损伤的预保护及修复作用。结果表明,Aβ可以引起神经细胞毒性作用,造成细胞存活率下降。当在细胞中预先加入不同浓度的四种肝素寡糖作用24h后,对Aβ引起的细胞损伤具有明显的抑制作用,细胞存活率明显提高,且随着药物浓度增加,这种抑制作用显著增强,表明四种肝素寡糖对Aβ引起的神经细胞损伤具有明显的预保护作用。本实验还研究了Aβ对神经细胞损伤不同时间段的修复作用,结果表明,当用老化的Aβ1-40蛋白损伤神经细胞24h后,50、100ug/ml的四种肝素寡糖均对神经细胞损伤具有较好的修复作用,而当用老化的Aβ1-40蛋白损伤神经细胞36h、48h,只有100ug/ml的四种肝素寡糖才可发挥较好的修复作用。3四种肝素寡糖对Aβ构象变化的影响采用圆二色谱技术研究了肝素寡糖对Aβ构象变化的影响。由CD图谱可以看出,Aβ在37℃单独孵育1天基本以α-螺旋和无规卷曲的形式存在,当孵育7天后,Aβ逐渐向β-折叠形式转变，α螺旋和无规卷曲构象逐渐减少；在肝素存在条件下,Aβ迅速向β-折叠构象转变,孵育7天后,基本以β-折叠形式存在；而当在四种肝素寡糖存在时,可明显抑制Aβ由α-螺旋向β-折叠构象转变。综上所述,肝素寡糖可通过与Aβ紧密结合,抑制其构象转变,从而抑制Aβ纤维丝的形成,进而抑制Aβ对神经细胞的毒性损伤,因此,肝素寡糖有望开发成为抗老年痴呆新药应用于临床。

全文目录

目录  4-7
CONTENT  7-10
摘要  10-13
ABSTRACT  13-16
符号说明  16-18
第一章前言  18-26
  1 阿尔兹海默症的发病机制  19-22
    1.1 中枢神经系统胆碱能功能障碍  19
    1.2 淀粉样蛋白级联假说  19-21
    1.3 神经炎症假说  21-22
    1.4 其他病理机制  22
  2 肝素的生物学功能  22-23
  3 糖胺聚糖、肝素与阿尔兹海默症  23-25
    3.1 肝素及其抗炎作用  23-24
    3.2 肝素和金属离子  24
    3.3 肝素与载脂蛋白E  24-25
  4 展望  25
  5 本课题拟解决的问题  25-26
第二章肝素寡糖的制备和分离纯化  26-35
  1 材料  26
    1.1 材料与试剂  26
    1.2 仪器  26
  2 实验方法  26-29
    2.1 酶解  26-27
    2.2 酶解条件的优化  27
    2.3 分离纯化  27-28
    2.4 MS的测定  28
    2.5 电泳  28-29
  3 结果  29-33
    3.1 肝素寡糖分离纯化的结果  29-32
    3.2 MS的测定  32
    3.3 电泳测定结果  32-33
  4 讨论  33-35
第三章肝素寡糖对AB引起神经细胞损伤的预保护及修复作用  35-52
  1 材料与试剂  35-36
    1.1 材料  35
    1.2 实验仪器  35
    1.3 细胞  35-36
    1.4 试剂的配制,  36
  2 方法  36-39
    2.1 Aβ_(1-40)对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞活力影响  36
    2.2 肝素寡糖对Ap_(1-40)诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的预保护及修复用  36-37
    2.3 Aβ_(10-35)对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞活力影响  37
    2.4 肝素寡糖对Aβ片段诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y损伤的预保护及修复作用  37-38
    2.5 肝素寡糖对Aβ_(1-40)诱导(褐家鼠)肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的预保护及修复作用  38
    2.6 肝素寡糖对Aβ片段诱导(褐家鼠)肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的预保护及修复作用  38-39
  3 统计学分析  39
  4 结果  39-50
    4.1 Aβ_(1-40)对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞活力影响  39-40
    4.2 Aβ_(10-35)对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞活力影响  40
    4.3 肝素寡糖对Aβ_(1-40)、Aβ片段诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的预保护及修复作用  40-46
    4.4 肝素寡糖对Aβ_(1-40)、Aβ片段诱导(褐家鼠)肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的预保护及修复作用  46-50
  5 讨论  50-52
第四章圆二色谱法研究四种肝素寡糖对AB构象变化的影响  52-60
  1 实验材料  52-53
    1.1 实验材料  52
    1.2 实验仪器  52
    1.3 试剂配制  52-53
  2 实验方法  53
  3 结果  53-58
  4 讨论  58-60
论文总结和创新  60-61
创新性  61-62
附图  62-66
附表  66-71
参考文献  71-81
致谢  81-82
攻读硕士学位期间发表的学术论文  82-83
学位论文评阅及答辩情况表  83

肝素寡糖抑制β淀粉样蛋白细胞毒性的结构关系研究

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