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国产重组抗CD20单克隆抗体的临床前药效学和药代动力学研究

作　者: 刘若瑞
导　师: 程远国
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: CD20 Rituximab ELISA 药代动力学 药效学
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


国产重组抗CD20单抗与国外已上市同类药Rituximab比较,是否具有相似或更好的与肿瘤细胞表面CD20分子的结合力、体内外药效作用以及相似的动物体内药代动力学特征。按照新生物制品有效性研究的要求,提供国产重组抗CD20单抗体内外药效学及临床前药代动力学研究资料。本研究分为两个部分:第一部分:国产重组抗CD20单抗抗肿瘤作用的药效学研究1、选用两种CD20高表达的肿瘤细胞（Raji细胞、Daudi细胞）和CD20阴性细胞（MX-1细胞）,用乳酸脱氢酶（LDH）法细胞杀伤试验试剂盒检测重组抗CD20单克隆抗体体外对肿瘤细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC作用）,并与对照品Rituximab比较,评价国产重组抗CD20单抗的体外CDC作用。国产药rh-anti-CD20ximAb对CD20阳性的Raji和Daudi细胞的体外CDC效应非常明显,而且与对照品Rituximab的溶解细胞的CDC效应非常相似:对Raji细胞的3次重复平均半数有效抑制浓度(IC50)分别为740±76 ng/mL和809±39 ng/mL,平均EC50比值为91.31±5.27 %。对Daudi细胞的3次重复平均半数有效抑制浓度(IC50)分别为729±57 ng/mL和846±145 ng/mL,平均EC50比值为87.42±7.88%。2、选用两种CD20高表达的肿瘤细胞（Raji细胞、Daudi细胞）和CD20阴性细胞（MX-1细胞）作为靶细胞,用人外周血单核细胞（PBMC）作为效应细胞,在不同的效:靶比条件下,用乳酸脱氢酶（LDH）法细胞杀伤试验试剂盒检测重组抗CD20单克隆抗体体外对肿瘤细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC作用）,并与对照品Rituximab比较,评价国产重组抗CD20单抗的体外ADCC作用。国产药rh-anti-CD20ximAb对CD20阳性的Raji、Daudi细胞的体外ADCC效应非常明显,而且与对照品Rituximab溶解细胞的ADCC作用非常相近。对于Raji、Daudi细胞,在效:靶比分别为100:1、40:1、16:1、6:1情况下,国产药与对照药都随着效:靶比的降低,其对Raji和Daudi细胞的杀伤率也随之降低,但二者在相同效:靶比下,对Raji和Daudi细胞的杀伤率接近。而对于CD20阴性细胞MX-1,二者对MX-1细胞的杀伤率都在10%以下。3、国产重组抗CD20单抗体外与CD20高表达人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞的高亲和力结合,此实验包括饱和结合试验和竞争性抑制试验。饱和结合结论说明国产rh-anti-CD20ximAb可以与CD20高表达B-淋巴细胞瘤Raji细胞高亲和,可逆性,低容量地结合。竞争性抑制实验结论说明国产rh-anti-CD20ximAb和对照品Rituximab对高表达CD20抗原人B细胞淋巴瘤Raji细胞与125I-rh-anti-CD20ximAb结合的抑制作用相似,二者的IC50值分别为3.13±0.38μg/mL和3.45±0.59μg/mL,两者非常接近。4、猕猴静脉滴注重组抗CD20单抗和对照品后,观察猕猴外周血中的B淋巴细胞水平,三个剂量组之间比较及与对照品比较,观察国产药在猕猴体内是否达到了与对照品相似的CDC作用和ADCC作用。流式细胞仪检查表明猕猴药前C20阳性的B淋巴细胞量都在14.37-47.91%之间,各组间比较无统计差别。相同剂量的受试品和对照品(30 mg·kg-1?1),注射后2h-20d内,二者在统计学上均无明显差别（P>0.05）。第二部分:国产重组抗CD20单抗的临床前药物代谢动力学研究。1、建立了双抗夹心ELISA法检测猴血清中的重组抗CD20单抗的浓度。经过方法学确证,该方法的标准曲线、特异性、板内和板间精密度、准确度、LLOQ、回收率、稳定性及样品稀释倍数的影响均满足重组抗CD20单克隆抗体的药代动力学研究的要求。2、研究单次低、中、高(10、30和100 mg·kg-1)三个剂量组滴注给药后和中剂量(30 mg·kg-1)连续4次静脉滴注给药后,国产重组抗CD20单抗在猕猴体内的药物代谢动力学情况,并比较中剂量给药后与同剂量的对照品Rituximab给药后的药动学特征。猕猴单次静脉滴注10,30和100 mg·kg-1国产rh-anti-CD20ximab后,多数猕猴在给药后0.5h血清药物浓度达到最高,血清药物浓度随着滴注剂量的增高而增高,末端相半衰期随着剂量的增加无显著延长,低、中、高剂量组在给药后480h血清药物浓度下降到峰浓度的1/10～1/20。对各组药代动力学参数比较,平均驻留时间随着剂量的增加并没有延长。剂量之比为1:3:10,AUC的增长为1:3.0:9.2,与剂量成正比例增加。全身清除率CLS随剂量增加并没有显著变化,具有线性动力学特征。猕猴间隔7天静脉滴注国产rh-anti-CD20ximab,连续4次给药后,第4次给药后的血清药物浓度和药物代谢动力学参数跟首次比较,有统计学意义上的差别（P<0.01）,三只猴第4次给药后和首次给药后给药间期的AUC0-ι比值(AUC0-ι（第4次）/AUC（0-ι（第1次））)分别为1.72、1.87和1.84;平均为1.81±0.08,表明国产rh-anti-CD20ximab在30mg·kg-1剂量下间隔7天连续给药4次后在猕猴体内可能有药物蓄积作用。猕猴静脉滴注对照品Rituximab和受试品国产rh-anti-CD20ximab实验结果显示,各只猴中对照品Rituximab和受试品制品国产rh-anti-CD20ximab的药-时曲线,就总体而言,图形较为吻合,且数值相近。3只猕猴对照品和受试品浓度的Student`s配对t-检验,在给药后所有时间点受试品与对照品平均浓度均无统计学意义差别（P>0.05）。而药代动力学结果提示,二者所有的药物代谢动力学参数AUC0-480h、MRT、CLS、VSS、Cmax均无统计学意义（P>0.05）,表明国产rh-anti-CD20ximab与罗氏公司的Rituximab药物代谢动力学行为相近。

全文目录


缩略词表  6-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
引言  13-16
第一部分 重组抗 CD20 单抗的药效学研究  16-41
  第一节 B 淋巴瘤细胞 Raji、Daudi 及阴性细胞 MX-1 中 CD20 阳性细胞量测定  16-19
  第二节 国产重组抗CD20 单抗对B 淋巴瘤细胞的体外CDC 作用的研究  19-26
    1、材料与方法  19-21
      1.1 药品与试剂  19
      1.2 受试细胞  19
      1.3 仪器  19
      1.4 实验方法  19-21
        1.4.1 实验原理  19-20
        1.4.2 实验步骤  20
        1.4.3 数据处理  20-21
    2、结果  21-25
    3、小结  25-26
  第三节 国产重组抗CD20 单抗对B 淋巴瘤细胞的体外ADCC 作用的研究  26-31
    1、材料与方法  26-28
      1.1 药品与试剂  26
      1.2 受试细胞  26
      1.3 仪器  26
      1.4 实验方法  26-28
        1.4.1 实验原理  26-27
        1.4.2 实验步骤  27-28
    2、结果  28-30
    3、小结  30-31
  第四节 ~(125)I-rh-anti-CD20ximab 制备、鉴定及生物活性的测定  31-36
    1、材料与方法  31-32
      1.1 药品与试剂  31
      1.2 受试细胞  31
      1.3 仪器  31
      1.4 实验方法  31-32
        1.4.1 rh-anti-CD20ximab 的 ~(125)I 标记  31
        1.4.2 标记反应物的分离纯化  31-32
        1.4.3 ~(125)I-rh-anti-CD20ximab 含量测定  32
        1.4.4 纯度鉴定  32
        1.4.5 标记后生物活性测定  32
    2、结果  32-36
  第五节 国产重组抗 CD20 单抗体外与 CD20 高表达人 B 细胞淋巴瘤细胞系 Raji细胞的高亲和力结合  36-41
    1、材料与方法  36-38
      1.1 药品与试剂  36
      1.2 受试细胞  36
      1.3 仪器  36
      1.4 实验方法  36-38
        1.4.1 实验原理  36-37
        1.4.2 实验步骤  37-38
    2、结果  38-40
    3 小结  40-41
第二部分 国产重组抗 CD20 单抗在猕猴体内的药效学实验  41-49
  1、材料与方法  41-43
    1.1 药品与试剂  41
    1.2 仪器  41
    1.3 实验动物和分组  41-42
    1.4 实验方法  42-43
      1.4.1 实验原理  42
      1.4.2 实验步骤  42-43
  2、结果  43-48
  3、小结  48-49
第三部分 重组抗CD20单抗的临床前药代动力学研究  49-73
  第一节 双抗夹心ELISA法检测猴血清中重组抗CD20单抗的方法学建立和确认  49-56
    1、材料与方法  49-50
      1.1 药品与试剂  49
      1.2 仪器  49
      1.3 实验方法  49-50
        1.3.1 实验原理  49-50
        1.3.2 试剂配置  50
        1.3.3 检测步骤  50
    2、结果  50-55
    3、小结  55-56
  第二节 重组抗 CD20 单抗在猕猴体内的药代动力学研究  56-73
    1、材料与方法  56-57
      1.1 药品与试剂  56
      1.2 仪器  56
      1.3 实验动物和分组  56
      1.4 血清标准曲线和质控样品的制备  56-57
      1.5 猕猴单次静脉滴注国产重组抗CD20 单抗的药代动力学研究  57
      1.6 猕猴连续静脉滴注国产重组抗 CD20 单抗的药代动力学研究  57
    2、结果  57-71
    3、小结  71-73
讨论  73-78
参考文献  78-81
综述  81-88
  参考文献  86-88
发表文章  88-91

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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