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百里酚及异百里酚的体外代谢研究

作　者: 董瑞华
导　师: 宋三泰; 刘泽源
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 百里酚异百里酚体外代谢代谢酶结构药代关系
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

百里酚和异百里酚是百里香属、薄荷香属等药用植物中广泛分布的单酚类化合物,它们在结构上互为同分异构体。作为百里香属、薄荷香属植物的主要活性成分,百里酚和异百里酚显示了良好的抗氧化、抗炎、抗菌及抗肿瘤等药理学活性,是多味中药产生疗效的物质基础。此外,这两个化合物还作为食品添加剂(FDA和欧盟批准)被广泛应用于食品工业中。借助体外技术体系开展中药活性成分在人体及动物组织的吸收、分布、代谢及排泄(ADME)等性质研究,不仅有助于揭示中药的活性物质基础及其在人体及动物体内的处置进程,进而选择适宜动物模型来开展整体药代、药理及毒理研究;还对科学解释中药体内作用机制以及中草药药物的相互作用具有重大作用。百里酚和异百里酚作为多种药食同源中草药的主要活性成分,其在人体内的代谢转化及其对代谢酶活性的影响对临床安全用药至关重要。然而,到目前为止,对上述两个单酚类化合物的体内代谢途径尚不清楚,其代谢稳定性及代谢行为、以及是否引发药物药物相互作用(DDⅠ)等科学问题至今未得到很好的研究,而这些性质对中药自身以及与其共服药物的有效性和安全性均会产生重大影响。同时,百里酚和异百里酚在多种食物和中草药中大量存在,在人们食用富含百里酚和异百里酚的食物时其与其它食物和药物的相互作用,非常值得我们关注,尤其是对患者在临床用药中的药物膳食结构更应引起我们的注意。酚类化合物在中草药中广泛存在且结构多样、而且多具有抗氧化、抗炎、抗菌等活性,其不但为新药研发提供了广阔的资源,同时其代谢产物又进一步丰富了化合物的结构多样性。药物代谢性质的研究,对先导化合物的优化、中药作用机理的发现及药物的安全有效使用均具有重要意义。同时多数酚类化合物均是Ⅱ相代谢酶的天然底物,包括磺酸化酶,甲基化酶,葡萄糖醛酸化酶(UGT)等Ⅱ相代谢酶;但作为人体主要代谢酶的细胞色素氧化酶P450更倾向于代谢含有疏水基的化合物,然而既含有酚羟基又具有疏水基的物质其在人体内代谢行为,及在特定化合物中CYP与UGT代谢的重要性至今鲜有报道。本研究利用人肝及动物肝微粒体等体外孵育体系,对百里酚和异百里酚的体外代谢稳定性、代谢酶动力学、种属差异、药物相互作用以及化合物结构对药物代谢行为的影响进行了系统研究。本论文首先建立了百里酚和异百里酚的高效液相检测方法;所建立的方法具有很好的特异性;精密度和准确度及稳定性等研究均符合方法学的要求;经过方法学验证,该方法可以满足百里酚和异百里酚两种化合物在后续研究中的定量要求。在此基础上,论文着重对百里酚和异百里酚进行了体外Ⅰ、Ⅱ相酶代谢研究,阐明了两化合物的代谢途径;同时考察了两化合物代谢的种属差异及药物相互作用的效应。本论文系统研究了百里酚和异百里酚体外Ⅰ相代谢,阐明了两化合物在人肝中的Ⅰ相代谢途径。在人肝微粒体孵育体系中,百里酚在能生成一个羟化代谢产物(M 1),异百里酚能够生成两个羟化代谢产物(M 1,M 2)。进一步研究证实,CYP1A2、CYP2A6和CYP2B6参与了百里酚的Ⅰ相代谢,CYP1A2、CYP2A6参与了异百里酚Ⅰ相代谢M 1的生成,CYP1A2、CYP2A6和CYP2B6则参与介导了M 2的生成。在不同种属间的代谢能力表现出较大的差异,依据研究的不同目的,可以选择不同的实验动物作为模型。在研究原形的毒性时,可能要考虑清除比较慢的动物。在研究代谢产物的毒性时,可能要考虑代谢转化较快的动物。各种属对百里酚和异百里酚CYP代谢能力的差异,也提示在未来工作中,深入研究代谢物的活性及毒性是非常有必要的。本论文同时研究了百里酚和异百里酚体外Ⅱ相代谢,阐明了两化合物在人肝和人肠中的Ⅱ相代谢途径。在人肝和人肠微粒体孵育体系中,百里酚和异百里酚都能生成一个单葡萄糖醛酸结合物。进一步研究证实,两化合物的葡萄糖醛酸结合代谢都是多酶参与的过程,其中UGT1A3、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9和UGT2B7能催化百里酚的葡萄糖醛酸化代谢,UGT1A3,UGT1A6,UGT1A7,UGT1A9和UGT2B7能催化异百里酚的葡萄糖醛酸化代谢。通过抑制剂研究发现,UGT1A9在人肝脏代谢中起主要作用,UGT1A7在人肠代谢中起主要代谢作用。两个化合物在不同种属间的葡萄糖醛酸化代谢酶谱尽管没有区别,但是代谢活性还是存在着较大的差异,需要在后续研究中依照不同的研究目的选择合适的动物代谢模型。通过比较百里酚和异百里酚的Ⅰ、Ⅱ相代谢发现,异百里酚无论在Ⅰ相还是Ⅱ相酶代谢过程中,均表现出了比百里酚较高的代谢活性和相对高的代谢清除率。尤其是在Ⅱ相葡萄糖醛酸化代谢中表现更为明显。同时发现,在百里酚的Ⅰ相、Ⅱ相代谢比较中,CYP代谢路径的代谢清除率占有更大优势,可能是其主要的代谢途径。在异百里酚的代谢中,UGT代谢所起的作用更加重要,暗示疏水集团和酚羟基的空间距离在决定药物代谢途径和代谢快慢上具有重要作用。本论文还考察了百里酚和异百里酚引发DDⅠ的可能性,研究发现异百里酚能够抑制UGT1A9的活性。该抑制表现出了明显依赖于酶或底物的特点。通过异百里酚对UGT特异性探针底物4 MU和异丙酚抑制作用的能力来评价其导致DDⅠ的可能性。结果发现,异百里酚对4 MU在UGT1A9代谢中产生了竞争性的抑制作用(Ki=5.7 M),而在对异丙酚在UGT1A9单酶代谢中产生了非竞争性的抑制作用(Ki=25.0 M)。所以在临床或者食用异百里酚的过程中需要注意DDI的可能性作用。比较两种化合物的结构并结合国内外已有文献,发现疏水基远离酚羟基的化合物更趋向于发生Ⅱ相化代谢;同时其代谢酶谱也产生一定的差异,代谢能力也发生很大的变化;这可能是由于疏水基空间位阻的作用产生了上述的影响。以上发现提示小分子化合物结构上的微小变化,都可能会导致代谢途径的巨大差异。在模式实验动物选择中应选择与人具有相似代谢行为和代谢能力的动物来开展整体动物实验,若利用了不合适的动物模型进行临床前研究可能会产生较大差异、从而影响临床实验的设计及数据的可靠性。本研究对百里酚和异百里酚的体外代谢系统研究,首次报道揭示了它们的代谢通路,有助于对该类化合物在药物早期研究中的‘成药性’进行评估。同时丰富了单酚类化合物的药代动力学研究,对此类化合物的后续研究提供了理论依据和实验支持。也对临床药物膳食结构具有一定的指导意义。

全文目录

英文缩略词表  8-10
中文摘要  10-13
ABSTRACT  13-17
前言  17-20
第一章百里酚和异百里酚高效液相检测方法的建立  20-25
  1.1 引言  20
  1.2 材料和方法  20-21
    1.2.1 仪器和试剂  20
    1.2.2 贮备液和工作液的配制  20
    1.2.3 百里酚与异百里酚及相应代谢产物的色谱条件  20-21
    1.2.4 样品处理  21
  1.3 方法学验证  21
    1.3.1 特异性  21
    1.3.2 定量下限（LLOQ）和标准曲线的制备  21
    1.3.3 精密度与准确度  21
    1.3.4 稳定性  21
    1.3.5 回收率实验  21
  1.4 结果  21-23
    1.4.1 HPLC 检测方法的特异性  21-22
    1.4.2 标准曲线与定量下限  22
    1.4.3 精密度与准确度  22-23
    1.4.4 稳定性  23
    1.4.5 回收率  23
  1.5 讨论  23-24
  1.6 小结  24-25
第二章百里酚体外Ⅰ 相代谢的研究  25-38
  2.1 引言  25
  2.2 材料和方法  25-28
    2.2.1 仪器和试剂  25-26
    2.2.2 肝微粒体的制备和表征  26
    2.2.3 孵育体系  26
    2.2.4 LC/MS 条件  26
    2.2.5 化学抑制研究  26-27
    2.2.6 人重组CYP 酶与百里酚的反应  27
    2.2.7 百里酚对各个CYP 亚型的抑制作用  27-28
    2.2.8 种属差异性研究  28
    2.2.9 动力学分析  28
  2.3 结果  28-36
    2.3.1 百里酚代谢产物的结构鉴定  28-30
    2.3.2 化学抑制剂研究  30-31
    2.3.3 人的重组CYP 酶与百里酚反应  31
    2.3.4 百里酚对各个CYP 亚型的抑制作用  31
    2.3.5 百里酚P450 代谢的种属差异  31-32
    2.3.6 百里酚的动力学特征  32-36
  2.4 讨论  36
  2.5 小结  36-38
第三章异百里酚体外Ⅰ 相代谢的研究  38-50
  3.1 引言  38
  3.2 材料和方法  38-39
    3.2.1 仪器和试剂  38
    3.2.2 肝微粒体的制备和表征  38
    3.2.3 孵育体系  38-39
    3.2.4 LC/MS 条件  39
    3.2.5 化学抑制研究  39
    3.2.6 人重组CYPs 酶与异百里酚的反应  39
    3.2.7 异百里酚对各个CYP 亚型的抑制作用  39
    3.2.8 种属差异性研究  39
    3.2.9 动力学分析  39
  3.3 结果  39-48
    3.3.1 异百里酚代谢产物的结构鉴定  39-41
    3.3.2 化学抑制剂研究  41-42
    3.3.3 人的重组CYP 酶与异百里酚反应  42-43
    3.3.4 异百里酚对各个CYP 亚型的抑制作用  43
    3.3.5 异百里酚P450 代谢的种属差异  43-44
    3.3.6 异百里酚的动力学特征  44-48
  3.4 讨论  48-49
  3.5 小结  49-50
第四章百里酚的体外Ⅱ 相代谢研究  50-66
  4.1 引言  50
  4.2 材料和方法  50-54
    4.2.1 仪器和试剂  50-51
    4.2.2 肝、肠微粒体的制备和表征  51
    4.2.3 孵育体系  51-52
    4.2.4 LC/MS 条件  52
    4.2.5 人重组UGT 单酶与百里酚的反应  52-53
    4.2.6 异丙酚对百里酚葡萄糖醛酸化的抑制  53
    4.2.7 百里酚对4 MU 葡萄糖醛酸化的抑制  53-54
    4.2.8 种属差异性研究  54
    4.2.9 动力学分析  54
  4.3 结果  54-63
    4.3.1 百里酚葡萄糖醛酸化代谢产物鉴定  54-55
    4.3.2 人重组UGT 酶与百里酚的反应  55-56
    4.3.3 异丙酚对百里酚葡萄糖醛酸化的抑制  56
    4.3.4 百里酚对4 MU 葡萄糖醛酸化的抑制  56
    4.3.5 种属差异  56-57
    4.3.6 百里酚葡萄糖醛酸化代谢的动力学特征  57-63
  4.4 讨论  63-64
  4.5 小结  64-66
第五章异百里酚的体外Ⅱ 相代谢研究  66-83
  5.1 引言  66
  5.2 材料和方法  66-68
    5.2.1 仪器和试剂  66
    5.2.2 肝、肠微粒体的制备和表征  66
    5.2.3 孵育体系  66-67
    5.2.4 LC/MS 条件  67
    5.2.5 人重组UGT 单酶与异百里酚的反应  67
    5.2.6 异丙酚对异百里酚葡萄糖醛酸化的抑制  67
    5.2.7 异百里酚对4 MU 葡萄糖醛酸化的抑制  67
    5.2.8 种属差异性研究  67
    5.2.9 动力学分析  67-68
  5.3 结果  68-79
    5.3.1 异百里酚葡萄糖醛酸化代谢产物确定  68-69
    5.3.2 异百里酚与重组UGT 酶的反应  69-70
    5.3.3 异丙酚对异百里酚葡萄糖醛酸化的抑制  70-72
    5.3.4 异百里酚对4 MU 葡萄糖醛酸化的抑制  72
    5.3.5 异百里酚葡萄糖醛酸化代谢的种属差异  72-73
    5.3.6 异百里酚葡萄糖醛酸化代谢的动力学特征  73-79
  5.4 讨论  79-81
  5.5 小结  81-83
第六章异百里酚对人葡萄糖醛酸化酶的抑制研究  83-90
  6.1 引言  83
  6.2 材料与方法  83-85
    6.2.1 仪器和试剂  83-84
    6.2.2 肝微粒体的制备和表征  84
    6.2.3 异百里酚对异丙酚葡萄糖醛酸化的抑制  84
    6.2.5 抑制常数的测定  84-85
  6.3 结果  85-88
    6.3.1 异百里酚对异丙酚葡萄糖醛酸化的抑制  85
    6.3.2 异百里酚对葡萄糖醛酸化酶的抑制常数  85-88
  6.4 讨论  88-89
  6.5 小结  89-90
讨论  90-91
结论与展望  91-93
参考文献  93-102
综述  102-117
  参考文献  106-117
个人简历  117-119
致谢  119

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