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埃他卡林对脑神经血管单元的保护作用及其分子机制

作　者: 冉玉华
导　师: 汪海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 分子药理学
关键词: 缺氧脑损伤 神经血管单元 ATP敏感性钾通道 凋亡 线粒体 神经营养因子
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


脑血管疾病是威胁人类健康的重大疾病之一,具有高死亡率，高发病率和高并发症发生率的特点。调查显示全世界每年大约有795，000名的人群受到其危害，其相关治疗费用更是高达68.9亿美元。其中约70%为缺血性脑血管疾病。我国是脑血管疾病的高发国之一,并且近20年来其发病率一直呈上升趋势，脑血管疾病已成为我国人口的第二大死亡原因。目前针对其临床治疗的药物疗效有限，亟需研发具有新作用靶点和作用途径的缺血性脑血管疾病治疗药物。缺氧脑损伤的主要病理改变是脑缺氧导致神经元死亡,从而影响脑功能，在此过程中神经元、胶质细胞以及脑微血管内皮细胞自身的损伤、坏死和凋亡以及相互的影响是脑组织损伤过程的细胞变化基础。随着近年来医学界对中枢神经系统多种细胞形态和功能的再认识，神经血管单元（neurovascular unit，NVU）概念逐步得到医学界的认同。所谓NVU，是指由神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞、小胶质细胞及维持脑组织完整性的细胞外基质和他们之间的相互作用和相互联系构成的一个整体概念。NVU扩充了血脑屏障（Blood brain barrier，BBB）的内涵与外延，具有多种细胞组成的动态微环境结构特征。NVU与缺血性脑血管疾病的发生发展具有密切的关系,其作为一个功能模块，已日益成为治疗脑缺氧损伤研究的重要靶点之一。ATP敏感性钾离子通道(KATP通道)是细胞膜上可以偶联细胞兴奋性和能量代谢的受细胞内ATP浓度调控的、具有弱内向整流作用的一类重要分子。文献报道，KATP通道在大脑各区几乎均有表达，在神经血管单元的三种主要细胞神经元、胶质细胞和内皮细胞上也有分布表达。研究显示，该通道在生理条件下往往处于关闭状态，而在缺血/缺氧状态下开放，通过减少兴奋性递质的释放以及启动下游多条细胞信号通路，可在多种组织中发挥抗缺血/缺氧损伤的内源性保护作用。埃他卡林是我国具有自主知识产权的一类新药，具有脂肪胺结构的新结构类型的KATP通道开放剂，在国际上被列为第九类钾通道开放剂。他是小分子化合物能够透过血脑屏障。前期研究发现在沙土鼠双侧颈动脉结扎全脑缺血模型上发现埃他卡林对缺血所致动物行为异常具有明显的对抗作用，能够减少兴奋性递质的释放；能够剂量依赖性地减少全脑缺血所致海马CA1区锥体神经元的丢失。在脑卒中易感型自发性高血压大鼠盐负荷模型上发现，埃他卡林剂量依赖性地减少脑卒中的发生率和致死率，延缓卒中发生并延长存活时间；在减压缺氧大鼠脑损伤模型上发现，埃他卡林对高原脑水肿具有防治作用，能够维持血脑屏障的通透性，维持脑内离子平衡。但是埃他卡林作为ATP敏感性钾通道开放剂在缺氧脑损伤的模型上是否可以靶向神经血管单元发挥保护作用以及埃他卡林是如何针对缺氧脑损伤靶向于缺氧脑损伤进程中神经血管单元的功能的动态变化及其相互调节来发挥作用的，即埃他卡林实现神经血管保护作用的分子作用机制尚未阐明。进一步明确埃他卡林对缺氧性脑损伤的保护作用及其机制将为埃他卡林靶向神经血管单元发展成为针对神经损伤多元复杂病理机制诸多关键环节和高度激活的复杂信号转导级联反应的多潜能神经保护剂提供进一步的实验研究基础，也将为缺氧脑损伤的预防和治疗带来新的治疗策略。本研究从不同的层次来研究埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元的多环节多途径保护作用。在整体动物水平上，采用10%氧浓度常压缺氧舱，并结扎大鼠单侧颈总动脉造成缺氧脑损伤模型，证明埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤的神经保护作用。在细胞水平上，建立连二亚硫酸钠无糖环境诱导细胞糖氧剥夺缺氧损伤模型，通过神经血管单元（NVU）成员细胞神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞实验，证实埃他卡林具有抗缺氧损伤NVU细胞的保护作用。此外，本研究进一步探究埃他卡林激活KATP通道靶向神经血管单元抗缺氧脑损伤涉及的分子机制。研究得到了如下的结果：第一部分、埃他卡林对脑神经血管单元缺氧损伤的保护作用一、埃他卡林对神经血管单元主要细胞类型的保护作用1、神经血管单元细胞表达KATP亚型的差异RT-PCR结果显示，在NVU三种细胞中Kir6.1的m RNA表达不同，微血管内皮细胞﹤神经元﹤星形胶质细胞；SUR2B的m RNA表达也有差异，神经元﹤星形胶质细胞﹤微血管内皮细胞；在微血管内皮细胞中Kir6.1和Sur2B的表达比较也存在显著差异，Kir6.1﹤SUR2B。2、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞存活率的影响在体外细胞缺氧损伤模型下，给予0.01,0.1,到1mol/l的埃他卡林可以明显地提高NVU细胞包括神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞缺氧损伤后的存活率。3、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞LDH的释放的影响0.01,0.1,和1mol/l的埃他卡林后可以显著的降低NVU成员细胞在低氧损伤下LDH的释放量。埃他卡林的这种作用可以被KATP的阻断剂格列苯脲所阻断。二、埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤的保护作用1、埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤病理改变的影响利用大鼠单侧颈总动脉结扎并处于10%常压缺氧环境造成，大鼠缺氧脑损伤模型，用HE染色的方法观察大鼠脑组织的病理变化，结果发现损伤组大鼠脑皮层神经细胞间隙明显增大，血管周围间隙增大，神经元数量减少，神经胶质细胞肿胀增大，毛细血管扩张充血。不同剂量的埃他卡林给药组（2,4,8mg/kg，每天灌胃给予）仍可见少量的胶质细胞和血管周围空晕，随着剂量增大，脑组织损伤程度逐渐减轻。2、埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤血脑屏障通透性变化的影响通过透射电镜观察大鼠缺血缺氧脑损伤后血脑屏障的结构变化发现，正常情况下，可见血管外周间隙致密；缺血缺氧组大鼠血管和组织外周间隙增大，可见明显的间隙和空泡；不同剂量埃他卡林（2,4,8kg/mg，每天灌胃给予）组作用之后可见血管外周间歇有不同程度的减小。第二部分、埃他卡林对脑神经血管单元缺氧损伤保护作用分子机制的研究一、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤凋亡相关蛋白表达的影响1、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡形态学的影响Hoechest33258染色发现，神经血管单元细胞在缺氧损伤的环境中，体现细胞核染色质密度增加，浓缩集聚等典型的凋亡特征，而给予埃他卡林后，凋亡细胞数量下降，染色质浓缩程度减轻。2、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡率的影响流式细胞仪检测神经元、星形胶质细胞和内皮细胞的凋亡率，在缺氧条件下，较之正常组，凋亡率显著增高（P﹤0.05），三种细胞皆有类似的结果。给予0.01,0.1和1mol/l埃他卡林后，凋亡率显著降低。3、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元细胞抗凋亡作用强弱比较埃他卡林对神经元的抗凋亡作用与它对内皮细胞的抗凋亡作用存在显著差异，（P﹤0.025）。埃他卡林对抗缺氧损伤引起星形胶质细胞的凋亡作用与它对内皮的抗凋亡作用也明显差异，（P﹤0.017）。4、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡相关通路的影响缺氧损伤之后，神经元、星形胶质细胞以及内皮细胞中caspase-3mRNA和蛋白在模型组较之正常组均明显增高，0.01到1mol/l埃他卡林给药组中caspase-3mRNA和蛋白表达较之模型组都发生显著下调。0.01到1mol/l的埃他卡林处理细胞之后，NVU三种成员细胞中bax的mRNA表达较之模型组显著下降，而bcl-2的mRNA表达则明显升高。模型组细胞中caspase-9的蛋白表达明显升高，与正常组有显著差异，P﹤0.05。而埃他卡林作用组中caspase-9的蛋白表达显著下降。NVU细胞缺氧损伤后，Western blot的方法检查细胞胞浆中的cytC的蛋白表达较之正常对照明显增加，而1mol/l的埃他卡林可以逆转cytC的表达上调。此外，Western blot的方法还证实星形胶质细胞和微血管内皮细胞中pAkt/tAkt的蛋白表达在缺氧损伤后显著下调，而埃他卡林可以明显的上调pAkt/tAkt的蛋白表达。5、埃他卡林调节大鼠缺氧脑损伤脑组织凋亡相关蛋白表达情况大鼠缺氧脑损伤后，利用IHC的方法发现脑组织中Bcl-2的表达减少，同时Bax的表达增加，致Bcl-2/Bax的比值减小。当灌胃给予8mg/kg埃他卡林后，可以抑制脑缺血再灌注损伤所致的脑细胞凋亡，表明它具有神经保护作用。这一作用与其逆转Bcl-2表达下调，逆转Bax的表达上调以及对抗Caspase-3的表达上调有关。免疫组化的实验结果证实，在正常大鼠脑皮层中作为维持血脑屏障的成员之一的MMP-9呈现致密分布。大鼠发生缺氧脑损伤后，脑皮层组织中MMP-9的表达下降，血脑屏障通透性增加；8mg/kg的埃他卡林组大鼠脑皮层MMP-9的表达显著上升。正常大鼠脑组织中有一定量的pCREB表达，大鼠缺氧缺血脑损伤后pCREB的表达明显少于正常组，而给予埃他卡林的大鼠，脑组织中可见pCREB的表达较之模型组显著上升。pCREB可促进下游促神经营养因子的释放和细胞存活。二、埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤线粒体功能的影响1、埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤脑线粒体形态的影响缺氧缺氧损伤组大鼠脑线粒体，单位面积内数量下降，HE染色结果可见大部分线粒体膜出现破损的状态，线粒体嵴间隙变大，出现空泡。缺氧损伤后给予埃他卡林2mg/kg，线粒体数量有所增加，线粒体膜破损减轻，嵴间隙变小。2、埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤脑线粒体功能的影响大鼠缺氧脑损伤后，利用氧电极检查脑线粒体的各项指标发现发现，缺氧损伤组的ATP合成速率下降至（117.32±1.72），较之正常对照组（128.82±9.68），下降明显，P﹤0.05。而埃他卡林能增加大鼠缺氧脑损伤脑线粒体ATP合成速率达到（128.43±1.12）；埃他卡林能增加大鼠缺氧脑损伤脑线粒体磷/氧比即P/O比值（2.11±0.05）较之缺氧损伤组（2.08±0.04），有显著差异；埃他卡林能增强大鼠缺氧脑损伤脑线粒体的呼吸率（respiratory control rate，RCR）为（3.11±0.24），较之缺氧损伤组（2.91±0.23）有统计学差异。可见埃他卡林可以维持缺氧损伤线粒体后的形态和功能。3、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元细胞线粒体膜电位的影响经过缺氧损伤后NVU细胞经罗丹明123染色，发现罗丹明123的荧光强度都明显下降，说明线粒体膜电位明显下降。而埃他卡林预处理过的细胞经缺氧损伤之后，线粒体膜电位的下降得到一定程度的逆转。4、埃他卡林对维持神经血管单元细胞膜电位作用差异比较埃他卡林对神经元线粒体膜电位的维持作用和对内皮细胞的作用存在显著区别。5、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元ROS生成的影响采用DCFH-DA探针测定细胞内活性氧水平，发现在神经血管单元三种细胞正常状态下，几乎没有ROS的产生，低氧诱导损伤细胞之后，三种细胞内ROS的水平显著增加，较之正常组有明显差别，埃他卡林作用低氧损伤的细胞之后，细胞内的ROS水平较之损伤组显著下降，P﹤0.05。三、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元释放神经营养因子的影响1、埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元细胞BDNF,GDNF,CNTF,NGF释放的影响缺氧处理后的神经元分泌BDNF量与正常组比较，下降了78%（P <0.05），而微血管内皮细胞在埃他卡林处理之后，可以增加显著增加神经元的存活率，星形胶质细胞在缺氧损伤时，BDNF的分泌也出现显著下降的情况，与正常组比较BDNF的分泌下降到37%（P <0.05）。微血管内皮细胞经缺氧损伤后，内皮细胞分泌BDNF下降。经1mol/l的埃他卡林作用后，可以显著性增加细胞分泌BDNF。缺氧损伤可降低星形胶质细胞分泌GDNF，与正常组相比，GDNF的分泌下降到23%,（P <0.05）。经0.01-1mol/l的埃他卡林预处理缺氧损伤的细胞，其GDNF的分泌均有所增加。NVU细胞分泌CNTF和NGF的分泌也受到缺氧损伤而明显下降，而埃他卡林能不同程度的增加其分泌的减少，但是钾通道的拮抗剂格列苯脲并不能阻断埃他卡林的这种作用，提示埃他卡林虽然可能增加缺氧损伤后CNTF,NGF的分泌，ATP敏感性钾通道的激活并非直接作用，而只是参与了其中的某些调节环节，具体机制有待进一步研究。2、埃他卡林对大鼠缺氧脑损伤后大鼠皮层BDNF, TrkB蛋白表达的影响免疫组化的结果证实，在正常的大鼠脑皮层组织，BDNF主要分布于皮层的边缘区域。缺氧脑损伤之后，皮层部分BDNF的表达明显减少，但经埃他卡林2，4，8mg/kg处理后，大鼠皮层组织中BDNF的表达呈现浓度依赖性的增加。TrkB的变化与BDNF的表达呈现出一致的趋势。TrkB的蛋白表达在缺氧缺血之后，较之正常组显著下降，P <0.05。分别给予埃他卡林2，4，8mg/kg治疗，随着药物剂量的增加，可以逆转TrkB蛋白表达的下降，呈浓度依赖性的上调TrkB蛋白表达。3、埃他卡林处理后ECM,ACM对化学缺氧损伤神经血管单元细胞相互作用的影响经过缺氧损伤处理的神经元作为对照组不加任何药物干预，内皮细胞经过缺氧处理收集培养液（ECM），按相同的处理过程，从星形胶质细胞培养液中得到（ACM），实验证实，ECM和ACM分别与对照组的神经元共培养，均能增加神经元存活率，（E-CM:54.1%vs38.9%, P=0.04;A-CM:51.4%vs33.2%，P=0.03）。0.01μmol/L的埃他卡林处理ECM和ACM后，再与对照组神经元共培养，神经元的存活率进一步提高，分别为（E-CM vs Ipt+E-CM=54.1%vs78.2%, P=0.025;A-CM vs Ipt+A-CM=51.4%vs55.2%, P=0.045）。综上所述，本研究结论如下：1、ATP敏感性钾通道的开放剂埃他卡林能对神经血管单元低氧损伤发挥保护作用，在缺氧损伤的情况下，埃他卡林激活ATP敏感性钾通道可以保护神经元，星形胶质细胞和微血管内皮细胞，表现在缺氧损伤后它能增加细胞存活率，降低细胞释放LDH。2、ATP敏感性钾通道的开放剂埃他卡林能够对抗缺氧脑损伤，他可以维持血脑屏障的结构，降低MMP-9表达的病理性上调，从而降低脑水肿，维持血脑屏障的通透性而发挥神经保护作用。2、埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤的保护作用与其抑制缺氧损伤诱导的NVU细胞凋亡，维持脑线粒体的功能，阻止线粒体膜电位的丢失有关，降低ROS生成的增加。其抗凋亡作用涉及细胞凋亡线粒体途径的多个信号分子以及pAkt/tAkt的表达水平变化。可能与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关。此外，它可以上调后抗凋亡的bcl-2m RNA表达，下调促凋亡bax，caspase-3mRNA的表达；从蛋白水平，埃他卡林同时能下调Caspase-3蛋白表达。埃他卡林还能抑制CytC的蛋白释放，上调pAkt/tAkt的表达水平，下调Caspase-9的蛋白表达，从而多方面的抑制缺氧损伤引起的神经血管单元细胞凋亡的发生。4、埃他卡林保护神经血管单元的作用与其促进NVU细胞分泌释放神经营养因子BDNF，GDNF,NGF及CNTF相关，神经营养因子分泌的增加强化了神经血管单元细胞-细胞间的相互作用，维持NVU的动态平衡。5、在缺氧损伤的情况下，埃他卡林激活ATP敏感性钾通道可以靶向保护神经血管单元，这一效应与上游分子pCREB的表达增强有关，他的活化可以同时调节神经营养因子的释放并抑制细胞凋亡过程的发生，从而发挥细胞内源性神经保护作用。6、埃他卡林对NVU成员细胞的作用具有细胞选择性，对微血管内皮细胞的作用最强，这与内皮细胞上KATP的靶点Kir6.1，SUR2B表达丰度有关。

全文目录


缩略词表  6-7
中文摘要  7-14
Abstract  14-18
前言  18-22
材料与方法  22-38
  一 材料  22-25
    1 动物  22
    2 主要药品及试剂  22-25
    3 仪器设备  25
  二 实验方法  25-38
    1 细胞的原代培养  25-27
    2 免疫细胞化学实验  27-28
    3 原代细胞的鉴定  28-29
    4 MTT 测定细胞存活率  29-30
    5 LDH 测定实验  30
    6 HE 染色实验  30
    7 免疫组织化学  30-31
    8 荧光染色实验  31
    9 流式细胞仪测定细胞凋亡率实验  31
    10 细胞线粒体膜电位的测定  31
    11 RT-PCR/Realtime-PCR  31-33
    12 RIPA 裂解液提取蛋白  33
    13 Western Blot 实验  33-34
    14 透射电镜实验  34
    15 动物组织线粒体的提取  34-35
    16 氧电极测定线粒体功能  35
    17 ELISA 实验  35-36
    18 细胞缺氧模型的建立  36-37
    19 大鼠缺血缺氧模型的建立  37
    20 数据分析与统计处理  37-38
实验结果  38-82
  第一部分 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤的保护作用  38-51
    一 埃他卡林对神经血管单元主要细胞缺氧损伤的保护作用  38-44
      引言  38-39
      实验结果  39-44
        1 埃他卡林对神经血管单元细胞缺氧损伤细胞存活率的影响  39-40
        2 埃他卡林对神经血管单元细胞缺氧损伤 LDH 释放的影响  40-41
        3 神经血管单元细胞表达 KATP的情况  41-44
    二 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤的保护作用  44-50
      引言  44-47
      实验结果  47-50
        1 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑组织病理改变的影响  47
        2、埃他卡林对缺血缺氧脑损伤大鼠血脑屏障通透性变化的影响  47-48
        3、埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤大鼠皮层组织 MMP-9 的表达影响  48-50
    小结  50-51
  第二部分 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤保护作用的分子机制研究  51-82
    引言  51-53
    实验结果  53-81
      一 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤凋亡相关通路的影响  53-66
        1 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡形态学的影响  53-54
        2 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡率的影响  54-55
        3 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞抗凋亡作用差异比较  55-56
        4 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤细胞凋亡相关蛋白表达的影响  56-60
        5 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑组织凋亡相关蛋白表达的影响  60-66
      二 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑线粒体功能的影响  66-74
        1 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑线粒体形态的影响  66-67
        2 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑线粒体功能的影响  67-70
        3 埃他卡林对神经血管单元细胞缺氧损伤线粒脑线粒体膜电位的影响  70-71
        4 埃他卡林对神经血管单元细胞缺氧损伤线粒脑线粒体膜电位维持作用的差异  71-72
        5 埃他卡林对神经血管单元细胞低氧损伤 ROS 生成的影响  72-74
      三 埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元释放神经营养因子的影响  74-81
        1 埃他卡林对神经血管单元缺氧损伤分泌神经营养因子的影响  74-78
        2 埃他卡林对大鼠缺血缺氧脑损伤脑组织 BDNF，trkB 表达的影响  78-80
        3 埃他卡林对缺氧损伤神经血管单元细胞相互作用的影响  80-81
    小结  81-82
讨论  82-93
创新点  93-94
结论  94-96
参考文献  96-103
文献综述  103-115
  参考文献  111-115
个人简历  115-116
致谢  116

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