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重组人角质细胞生长因子C40-C106二硫键异构体的制备、鉴定与功效相关性的研究

作　者: 谢敏
导　师: 范开
学　校: 重庆理工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: KGF-1 40位-106位二硫键 HSC HFL-1 四氯化碳博来霉素
分类号: R914.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

人角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)自1989年Rubin等人从人胚胎肺成纤维细胞(M426)的培养液中分离出来,已被发现具有两种分型：KGF-1(即FGF-7)和KGF-2(即FGF-10)。其主要的生物学作用是促进上皮细胞的增殖和分化。本项目在Amgen公司缺失KGF-1N端23个氨基酸的基础上,突变其102位的半胱氨酸为丝氨酸并人工形成40位和106位这对二硫键发现：此突变体具有抗组织纤维化的功能。目的：本论文主要探讨KGF-1突变体蛋白的制备工艺,结构鉴定,人工形成40位和106位二硫键异构体的方法以及二硫键形成与否对其生物学功能的影响,从而为开发新型抗组织纤维化的药物和研究蛋白质的二硫键与其功能的相关性奠定基础。方法：(1) KGF-1突变体蛋白的制备工艺：将发酵好的重组工程菌破碎,洗涤后得到突变体蛋白的包涵体；包涵体经过SP Sepharose F.F和肝素柱亲和纯化得到突变体蛋白。(2) KGF-1突变体蛋白的复性方法：研究纯化好的KGF-1突变体蛋白人工形成40位和106位二硫键和完全不含二硫键的复性方法。(3) KGF-1突变体蛋白的结构鉴定：激光解析飞行时间色谱检验KGF-1突变体蛋白的分子量是否正确；RP-HPLC验证其纯度；氨基酸序列分析KGF-1突变体蛋白的一级结构；计算机模拟两种蛋白的空间构象；ELISA验证其KGF-1常规免疫结合位点是否改变；还原和非还原质量肽图鉴定其二硫键形成是否完全。(4) KGF-1突变体蛋白的生物学活性研究：通过人肝星状细胞,人肺成纤维细胞和大鼠肝星状细胞三种细胞株来研究两种异构体蛋白的体外生物学活性；通过四氯化碳造成的大鼠肝纤模型、博来霉素造成的大鼠肺纤模型以及乙醇造成的家兔角膜纤维化三种模型研究两种异构体蛋白的体内生物学活性。结果：(1)通过优化已有的纯化工艺最终得到电泳纯度为95%以上,RP-HPLC纯度为97%以上的未复性的KGF-1突变体蛋白。(2)通过对复性工艺的研究得到完全不含二硫键和含有40位和106位二硫键的两种突变体蛋白,两种目标蛋白纯度>99%。(3)质谱测定其分子量为16KD,氨基酸N端15个氨基酸测序结果与理论值相同；计算机模拟含有40位-106位二硫键突变体和不含二硫键突变体蛋白的空间结构得知两种突变体蛋白构象迥异；ELISA实验证明两种突变体蛋白与野生型KGF-1和K23相比,其免疫结合位点已经发生改变；质量肽图证明含有二硫键的突变体40位-106位二硫键形成完全。(4)体外细胞测活实验证明KGF-1突变体蛋白含40-106二硫键蛋白可以明显抑制人肝星状细胞,人肺成纤维细胞,轻微抑制大鼠肝星状细胞；体内大鼠肝纤模型证明两种突变体蛋白均可以明显改善已经形成的肝纤维化,体内大鼠肺纤维化证明其含二硫键突变体可以控制肺纤维化的病情,体内家兔角膜损伤实验证明了KGF-1含二硫键突变体可以明显改善已经纤维化的角膜组织,KGF-1突变体不含二硫键样品效果其次。结论：成功获得了两种高纯度的KGF-1异构体蛋白,并且证明了他们的空间构象在二硫键形成与否的情况下发生了改变,同时还确定了他们的体内外的生物学活性。KGF-1含二硫键突变体蛋白可以抑制组织纤维化相关细胞：人肝星状细胞,人肺成纤维细胞等的生长,而且体外三个动物实验模型证明KGF-1含40-106位二硫键突变体蛋白可以控制纤维组织的继续生成,KGF-1不含二硫键突变体效果其次。综上所述,两种新型的KGF-1二硫键突变体蛋白的体内外活性测定证明了其功能与蛋白质结构之间的关系,对于研发新型抗纤维化药物以及研究蛋白质的构效关系具有重大意义。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
英文缩略表  11-13
第一章引言  13-17
  1.1 KGF家族的研究概况  13
  1.2 KGF-1的研究概况  13-15
    1.2.1 关于KGF-1的结构  13
    1.2.2 关于KGF-1的受体  13-14
    1.2.3 关于KGF-1的调节  14
    1.2.4 关于KGF-1的生物学作用  14
    1.2.5 关于KGF-1突变的研究  14-15
  1.3 本课题的研究目的及内容  15-16
    1.3.1 本课题的研究目的  15-16
    1.3.2 本课题的研究内容  16
  1.4 本课题组研究的意义  16-17
第二章 rhKGF-1二硫键异构体的制备及结构鉴定  17-31
  2.1 主要仪器和试剂  17-19
    2.1.1 主要仪器  17-18
    2.1.2 主要试剂  18
    2.1.3 主要溶液配方  18-19
  2.2 实验方法  19-22
    2.2.1 未复性rhKGF-1二硫键异构体蛋白及K23的获得  19-20
    2.2.2 rhKGF-1二硫键异构体复性工艺的研究  20-21
    2.2.3 rhKGF-1二硫键异构体蛋白复性工艺的检测  21
    2.2.4 rhKGF-1二硫键异构体氨基酸测序  21-22
    2.2.5 rhKGF-1二硫键异构体分子量测定  22
    2.2.6 rhKGF-1二硫键异构体多聚体测定  22
    2.2.7 rhKGF-1二硫键异构体计算机模拟空间结构  22
    2.2.8 rhKGF-1二硫键异构体免疫结合位点的研究  22
  2.3 结果和讨论  22-30
    2.3.1 未复性rhKGF-1二硫键异构体蛋白的获得  22-24
    2.3.2 rhKGF-1二硫键异构体复性工艺的检测  24-26
    2.3.3 rhKGF-1二硫键异构体氨基酸测序  26-27
    2.3.4 rhKGF-1二硫键异构体质谱测定分子量  27
    2.3.5 rhKGF-1二硫键异构体多聚体测定  27-28
    2.3.6 rhKGF-1二硫键异构体计算机模拟其空间结构  28-29
    2.3.7 rhKGF-1二硫键异构体免疫结合位点的研究  29-30
  2.4 本章小结  30-31
第三章 rhKGF-1二硫键异构体的体内外活性研究  31-54
  3.1 主要仪器和试剂  31-33
    3.1.1 主要仪器  31
    3.1.2 主要试剂  31-32
    3.1.3 细胞株  32
    3.1.4 实验动物  32-33
  3.2 实验方法  33-36
    3.2.1 体外活性测定  33-34
      3.2.1.1 HSC细胞测活  33
      3.2.1.2 HFL-1细胞测活  33-34
      3.2.1.3 HSC-T6细胞测活  34
    3.2.2 体内抗纤维化活性测定  34-36
      3.2.2.1 大鼠抗肝纤维化模型  34
      3.2.2.2 大鼠抗肺纤维化模型  34-35
      3.2.2.3 家兔抗角膜纤维化模型  35-36
  3.3 结果  36-52
    3.3.1 体外活性测定结果  36-39
      3.3.1.1 HSC细胞测活  37
      3.3.1.2 HFL-1细胞测活  37-38
      3.3.1.3 HSC-T6细胞测活  38-39
    3.3.2 体内活性测定  39-52
      3.3.2.1 大鼠抗肝纤维化模型  39-43
      3.3.2.2 大鼠抗肺纤维化模型  43-49
      3.3.2.3 家兔抗角膜纤维化模型  49-52
  3.4 本章小结  52-53
  3.5 本章讨论  53-54
第四章结论与展望  54-55
致谢  55-56
参考文献  56-59
个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果  59

重组人角质细胞生长因子C40-C106二硫键异构体的制备、鉴定与功效相关性的研究

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