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金属元素标记结合质谱技术的蛋白质组多重定量新方法研究及应用

作　者: 王昕
导　师: 钱小红; 张养军
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析
关键词: 金属元素标记蛋白质组多重定量质谱技术金属元素螯合标签腾冲嗜热菌
分类号: R917
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

发展蛋白质组多重定量技术以精确测量多个不同生理或病理条件下的生物样本蛋白质组表达及翻译后修饰的量的变化，从而发现潜在的生物标志物和具有重要生物学意义的关键蛋白质，是当前蛋白质组学的研究热点。已发展的基于稳定同位素标记的蛋白质组多重定量方法，如iTRAQ标记方法，可以实现对蛋白质组的多重定量分析，但仍存在许多不足，如标记试剂制备困难，价格昂贵，对质谱分析仪器具有选择性，定量的准确性有待提高等。因此发展更加精确且价廉易得的蛋白质组定量方法和技术仍是当前蛋白质组学研究的重要目标和极具挑战性的任务之一。金属元素标记蛋白质组定量方法是近年来发展的一种新方法，拓展了蛋白质组定量的新思路。与稳定同位素标记方法相比，金属元素标记方法具有很多自身的特点：如制备金属标签的试剂价廉易得；可供选择的稀土金属元素多，具有发展成多重金属标记技术的可能性；具有与生物质谱技术和元素质谱技术联用，应用于蛋白质组相对和绝对定量的双重优势等。本文旨在建立价格相对低廉、定量稳定可靠的，应用于蛋白质组学的多重定量新方法。基于此，我们首次建立了标记肽段N-端的金属元素标记结合生物质谱技术的蛋白质组多重相对定量新方法及应用研究。首先，本研究选择大环化合物四氮杂环十二烷四乙酸（DOTA）的四种镧系金属（Tb，Ho，Tm和Lu）螯合物作为金属元素螯合标签（Metal Element ChelatedTag， MECT），并全面考察了影响金属元素标记反应的各种影响因素。通过四氮杂环十二烷四乙酸琥珀酰亚胺活化酯（DOTA-NHS-ester）与肽段胺基的共价键合反应，然后与四种镧系金属离子的螯合反应进行标记。在优化的反应条件下，标准合成肽段的金属元素标记效率高达99%，对腾冲嗜热菌样本的全蛋白胰酶酶解肽段也能实现高效率的标记，表明金属元素标记具有温和、稳定、高效和无肽段歧视的优点。其次，本研究建立了金属元素标记与基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术结合的蛋白质组多重相对定量新方法。以标准合成肽段和标准蛋白质为模型的研究结果表明：该方法在5倍的动态范围内有良好的线性相关性（R~2=0.99），较小的相对标准偏差（RSD≤13%）和合理的蛋白质多重相对定量准确性。而且，金属元素标记肽段在酸性介质下具有良好的稳定性。通过对金属元素标记肽段的质谱裂解行为的研究，发现金属标签在二级碎裂过程中十分稳定，碎片离子主要为连续的y离子和部分b离子，因而有利于未知肽段的定性鉴定，适于复杂生物样本的分析。然后，本研究建立了基于ESI-MS技术的金属元素标记蛋白质组多重相对定量新方法。先胍基化肽段的赖氨酸侧链氨基，仅对N-端氨基进行金属元素标记，然后结合ESI-LTQ-FT-MS/MS进行四重相对定量分析。通过对四重金属元素标记肽段的色谱-质谱行为考察，结果表明四重金属元素标记肽段具有相同的色谱保留和二级质谱裂解行为。与肽段原型相比，金属元素标记肽段的二级质谱碎片离子中，除连续的y-系列离子外，b系列离子的信号得到改善，提高了未知肽段定性鉴定的可靠性。以标准肽段和标准蛋白质混合物为模型的相对定量研究结果表明：该方法在0.1~10倍动态范围内的线性关系良好（R~2=0.99），在10倍差异内，对六种标准蛋白质混合物的四重相对定量的百分比误差为13%，标准偏差（SD）为9%，相对标准偏差（RSD%）在20%以内，表明该定量方法具有良好的准确性、重复性和精密度，显示了该定了方法在复杂生物样本的良好的应用价值。最后，本研究将金属元素标记结合纳升源反相高效液相色谱-电喷雾-线性离子阱-傅里叶变换离子回旋共振串联质谱（nano-RP-HPLC-LTQ-FT-MS/MS）技术的多重相对定量策略初步应用于四个不同温度培养的腾冲嗜热菌蛋白质组的相对定量研究。通过MaxQuant软件定性鉴定和定量计算，在99%置信度和至少两个非冗余肽段定量一个蛋白质的条件下，共发现差异表达显著（倍数＜0.5或＞2）的13个蛋白质，其中8个蛋白质随着腾冲嗜热菌的培养温度的升高而表达量逐渐上调；相反地，另外5个蛋白质的表达量呈下调趋势。13个差异蛋白中有7个蛋白质与文献报道的差异变化趋势一致，另外6个蛋白质尚没见文献报道。对差异蛋白功能的初步分析表明：已有文献报道的7个差异蛋白质分别属于生产和转化能力的蛋白质功能分子和分子伴侣蛋白两类。前者随着温度的升高而下调，而分子伴侣蛋白却随着温度的升高而上调。这些研究结果证实我们建立的金属元素标记定量新方法能较好地应用于实际样本的多重定量分析，为蛋白质组多重定量研究提供了一种新策略和新选择，也为进一步拓展金属元素标记方法在蛋白质组学研究中的应用奠定了良好的基础。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-13
缩略词索引  13-14
第一章前言  14-28
  1 基于质谱技术的蛋白质组相对定量方法研究及进展  14-24
    1.1 非标记定量方法  15-16
    1.2 稳定同位素标记方法  16-23
    1.3 金属元素标记定量方法  23-24
  2 基于质谱技术的蛋白质组绝对定量方法研究及进展  24-26
    2.1 基于 MRM-MS 技术的蛋白质组绝对定量方法  24-25
    2.2 基于 ICP-MS 技术的蛋白质组绝对定量方法  25-26
  3 小结  26
  4 本文立题依据  26-28
第二章多肽金属元素标记反应的优化  28-41
  1 材料与方法  28-30
    1.1 主要试剂  28
    1.2 仪器设备  28-29
    1.3 实验方法  29-30
    1.4 数据库检索  30
  2 结果与讨论  30-40
    2.1 镧系金属元素的选择  30-31
    2.2 金属元素标记的化学反应过程  31-32
    2.3 标记效率的计算  32
    2.4 标记反应的反应条件的优化  32-37
    2.5 赖氨酸侧链氨基的标记效率  37-39
    2.6 生物样本的金属元素标记效率  39-40
  3 小结  40-41
第三章金属元素标记结合MALDI-TOF-MS技术的蛋白质组多重相对定量方法的建立  41-59
  1 材料与方法  42-44
    1.1 药品和试剂  42
    1.2 仪器设备  42
    1.3 实验方法  42-43
    1.4 质谱分析  43-44
  2 结果与讨论  44-58
    2.1 金属元素标记肽段在酸性介质中的稳定性  44-45
    2.2 金属元素标记肽段与自由金属离子之间的交换现象考察  45-47
    2.3 金属元素标记结合 MALDI-TOF-MS 的多重相对定量方法研究  47-48
    2.4 马心肌红蛋白的金属元素标记多重相对定量研究  48-53
    2.5 金属元素标记肽段的 MALDI-TOF-MS/MS 行为  53-58
  3 小结  58-59
第四章金属元素标记结合 ESI-MS 技术的蛋白质组多重相对定量方法的建立  59-83
  1 材料与方法  60-63
    1.1 药品与试剂  60
    1.2 仪器设备  60
    1.3 实验方法  60-62
    1.4 质谱分析  62-63
    1.5 数据分析  63
  2 结果与讨论  63-81
    2.1 胍基化反应的优化  63-64
    2.2 胍基化-金属标记反应路线的考察  64-65
    2.3 金属元素标记肽段的反相色谱行为  65-68
    2.4 四重金属元素标记的多肽的 ESI-MS 行为  68-74
    2.5 金属元素标记的多重相对定量方法  74-79
    2.6 线性动态范围  79-80
    2.7 在六种标准蛋白质的多重相对定量中的应用  80-81
  3 小结  81-83
第五章金属元素标记的多重相对定量策略在腾冲嗜热菌差异蛋白质组分析中的初步应用  83-96
  概述  83-84
  1 材料与方法  84-88
    1.1 药品与试剂  84
    1.2 仪器设备  84
    1.3 实验方法  84-87
    1.4 质谱分析  87
    1.5 数据分析  87-88
    1.6 腾冲嗜热菌差异蛋白质功能意义分析  88
  2 结果与讨论  88-92
    2.1 腾冲嗜热菌蛋白质的提取及酶切  88-89
    2.2 标记效率的考察  89-90
    2.3 MaxQuant 软件定量准确性考察  90
    2.4 四个不同温度培养的腾冲嗜热菌的差异蛋白质组的相对定量  90-92
    2.5 差异蛋白质功能的初步分析  92
  3 小结  92-96
结论  96-97
参考文献  97-107
文献综述  107-114
附代表性论文  114-118
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  118-121
致谢  121-122

金属元素标记结合质谱技术的蛋白质组多重定量新方法研究及应用

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