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急性高原反应影响因素及靶向性创新药物提高机体缺氧耐力的研究

作　者: 舒玉刚
导　师: 汪海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 急性低氧甲苯磺烷唑胺碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）活性低氧耐力脑功能氧自由基 AQP-4 VEGF
分类号: R82
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

高原低氧特殊环境因素严重影响进驻高原地区部队官兵的身体健康和军事作业能力，降低部队的机动性和战斗力。现代高科技战争要求部队快速机动和远程部署，在此背景下，高原特殊环境因素与部队特殊作业因素的影响相互交织，对战斗人员健康和军事作业能力的危害更大、更严重。急性高原反应是平原部队急进高原途中和抵达高原后较常出现的临床症候群，若不及时治疗，可能继发高原肺水肿和高原脑水肿，从而危及生命。高原低氧可影响机体的神经、循环、呼吸、消化、内分泌和免疫等系统生理功能，是各类高原病的始动因素。1962年的中印边境自卫反击战，高原环境因素所致的非战斗减员是战斗减员的2.38倍，其中低氧占第一位。2010年玉树抗震救灾行动表明，如何快速有效地提高机体缺氧耐力、预防和减轻急性高原反应，是亟待解决的重要医学问题。大量研究表明，通过综合锻炼习服、阶梯式进驻高原习服、模拟高原低氧习服，均可有效提高机体对高原低氧的耐力，但这些措施皆不能适用于部队快速机动和应急情况疾进高原的需求。适当的登高策略和药物干预是快速进驻高原部队发生AMS较为现实的预防措施。为了适应西部大开发战略和国防建设的要求，研制新型急性高原反应防治药物，提升高原部队机动性有重要意义。自上世纪90年代以来，醋氮酰胺是美国FDA批准的针对这一适应证的唯一药物。甲苯磺烷唑胺（SUA）是我所合成并拥有自主知识产权的新型碳酸酐酶靶向性抑制剂，通过前期的药效学研究，已经初步确定甲苯磺烷唑胺具有提高小动物低氧耐受力的作用，较阳性对照药醋氮酰胺相比甲苯磺烷唑胺抗低氧能力更佳。本文分为两部分，第一部分对急进高原地区抗震救灾部队进行急性高原反应流行病学调查，分析急性高原反应发病率及其主要影响因素。第二部分在经典急性低氧损伤动物模型上，观察甲苯磺烷唑胺提高机体缺氧耐力的作用，并探讨其可能机制。第一部分高原抗震救灾部队急性高原反应发病率及其影响因素一、高原抗震救灾部队急性高原反应发病率的现场调查采用整群抽样的方法，应用规范化调查表，对急进玉树地区（海拔3800m）抗震救灾部队的697名官兵进行急性高原反应发病率现场调查，按中华人民共和国国家军用标准GJB1098-91《急性高原反应的诊断和处理原则》诊断急性高原反应。二、高原抗震救灾部队急性高原反应发病率的影响因素分析高原抗震救灾部队急性高原反应发病率为35.8%。Logistic单因素分析显示，原驻地海拔高度、交通工具、上呼吸道感染和高原进驻史与急性高原反应发病率相关（P＜0.01）。Logistic多因素分析显示，影响急性高原反应发病率的独立危险因素是空运和上呼吸道感染。发生急性高原反应的危险性空运是公路运输的24.4倍，患上呼吸道感染是未患上呼吸道感染发生急性高原反应危险性的77.4倍。第二部分靶向性创新药物提高机体缺氧耐力的作用及其机制一、甲苯磺烷唑胺提高机体整体水平缺氧耐力的作用及其机制（一）甲苯磺烷唑胺提高机体整体水平缺氧耐力的作用1．甲苯磺烷唑胺对密闭缺氧条件下机体缺氧耐力的影响将昆明小鼠随机分为17组（n=10）：正常对照组、8个剂量醋氮酰胺组[(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和400) mg/(kg·d)]和8个剂量甲苯磺烷唑胺组[(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和400) mg/(kg·d)]；灌胃5d后将动物放入缺氧装置瓶中，测定密闭缺氧存活时间(min)。在提高小鼠密闭缺氧耐力方面，甲苯磺烷唑胺[(6.25、12.5、25、50、100、200和400)mg/(kg·d)]剂量组的存活时间分别为[（27.38±4.63）、(29.53±4.43)、(29.67±7.28)、(31.55±6.34)、(32.45±6.65)、(36.81±7.24)和(35.41±4.20）min]，与对照组(22.90±3.19)min比较，显著延长（P＜0.05或P＜0.01）；与同等剂量醋氮酰胺组[(24.54±3.17)、(22.70±3.04)、(22.67±2.99)、(23.93±0.96)、（27.87±5.06）、（30.79±5.12）和（35.14±6.46)min]比较，存活时间明显延长；甲苯磺烷唑胺和醋氮酰胺最小有效剂量分别是6.25mg/(kg·d)及100mg/(kg·d)，甲苯磺烷唑胺是醋氮酰胺效价的16倍。2．甲苯磺烷唑胺对减压低氧条件下机体缺氧耐力的影响将雄性昆明小鼠随机分为5组（n=10）：正常对照组、醋氮酰胺组[100mg/(kg·d)]和低、中、高剂量甲苯磺烷唑胺组[25、50和100mg/(kg·d)]；灌胃5d后，将动物放于梯形笼中，置于小动物低压舱进行减压低氧，测定小鼠减压低氧存活时间(min)。在提高小鼠减压低氧耐力方面，甲苯磺烷唑胺中、高剂量组小鼠的存活时间分别为[（24.82±3.92）、(28.27±5.89）min]，明显长于对照组[(21.96±2.51)min，P＜0.05]；高剂量甲苯磺烷唑胺组的存活时间与醋氮酰胺组[（23.11±3.71）min]比较，明显延长(P＜0.05)。（二）甲苯磺烷唑胺提高机体整体水平缺氧耐力的机制1．甲苯磺烷唑胺对小鼠体内碳酸酐酶Ⅱ活性的影响将雄性昆明小鼠随机分为11组（n=8）：正常对照组、5个剂量醋氮酰胺组[(12.5、25、50、100和200)mg/(kg·d)]和5个剂量甲苯磺烷唑胺组[（12.5、25、50、100和200）mg/(kg·d)]；灌胃5d后取肾和脑，采用酶标仪测定组织匀浆液碳酸酐酶Ⅱ活性。与正常对照组相比，甲苯磺烷唑胺[(25、50、100和200) mg/(kg·d)]剂量组能显著抑制肾碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）活性(P＜0.05，P＜0.01)；甲苯磺烷唑胺[100及200mg/(kg·d)]剂量组能显著抑制脑碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）活性(P＜0.05)。2．甲苯磺烷唑胺对大鼠尿液量及其离子浓度的影响成年Wistar大鼠随机分为对照组和甲苯磺烷唑胺低中高3个剂量组[40、80和160mg/(kg·d)]。连续给药5d后，在水负荷条件下应用代谢笼收集6h尿液，测定尿量并采用原子吸光光度计测定尿中Na+、K+浓度，硝酸银滴定法测定Cl﹣浓度。甲苯磺烷唑胺中、高剂量组能显著增加大鼠尿量，与对照组比较差异显著(P＜0.05，P＜0.01)；甲苯磺烷唑胺中、高剂量组Na+、K+和Cl﹣排出量较对照组显著增加(P＜0.05，P＜0.01)。二、甲苯磺烷唑胺对急性缺氧所致脑损伤的干预作用及其机制（一）甲苯磺烷唑胺对急性缺氧所致脑损伤的干预作用1．甲苯磺烷唑胺对减压低氧所致大鼠自发活动的影响成年Wistar大鼠随机分为对照组、急性低氧组和甲苯磺烷唑胺3个预防给药组[(40、80和160)mg/(kg·d)]。模拟海拔8000m，低氧暴露12h，下舱后把各组大鼠放于旷场实验箱（100cm×100cm×50cm），进行旷场实验，检测急性低氧对大鼠自主探究行为的影响。与对照组比较，低氧组动物在旷场中的潜伏期延长，穿格数、直立次数和修饰次数减少，甲苯磺烷唑胺剂40mg/(kg·d)剂量组和160mg/(kg·d)剂量组动物的表现与低氧组相近，甲苯磺烷唑胺80mg/(kg·d)剂量组动物的旷场行为表现较急性低氧组显著改善。2．甲苯磺烷唑胺对减压低氧所致大鼠大脑皮层病理和含水量变化的影响做HE染色和醋酸铀及枸橼酸铅双染色，用光镜观察大脑皮层组织病理变化，观察甲苯磺烷唑胺对低氧所致脑损伤的影响。解剖学观察可见：低氧组脑回变宽而扁平,脑沟变窄浅，直观丰满，脑皮质水肿，潮湿发亮,质地较软，脑室因受压而缩小。光镜观察脑皮质主要改变：低氧组神经细胞及血管周围间隙增宽明显,部分区域增宽的血管周围间隙内可见少量积液。毛细血管扩张充血,神经胶质细胞水肿，细胞肿胀体积增大，胞膜不清，胞浆淡染。甲苯磺烷唑胺用药组则未见明显异常。以上结果表明急性低氧模型大鼠脑皮质出现明显的组织水肿病理改变，而预防给药甲苯磺烷唑胺可显著改善大脑皮质的损伤程度。采用干湿重法,取各组左脑大脑半球皮质,置于已称重的称量瓶中,称湿重,置于110℃恒温干燥箱内烘烤24h至恒重(两次称重差别≤0.2mg),称干重并用Elliot公式计算含水量百分率:含水量(%)=（湿重-干重）/湿重×100%低氧组大脑皮层含水量较对照组显著增加（P＜0.01），说明急性低氧12h出现明显的脑组织水肿，预防性给予甲苯磺烷唑胺后，40、80和160mg/(kg·d)3个剂量组含水量较低氧组显著降低（P＜0.01），且基本接近正常水平。（二）甲苯磺烷唑胺对急性低氧所致脑损伤干预作用的可能机制1．甲苯磺烷唑胺对减压低氧所致血脑屏障通透性变化的影响低氧时伊文思蓝（EB）的通透量较常氧组显著增加（P＜0.01）。醋氮酰胺组和甲苯磺烷唑胺的三个剂量组EB的通透量较急性低氧组降低，且醋氮酰胺组和甲苯磺烷唑胺80、160mg/kg剂量组EB的通透量下降显著（P＜0.01）2．甲苯磺烷唑胺对减压低氧所致大鼠大脑皮层氧自由基变化的影响低氧处理后，迅速下舱断头取左侧脑组织，称取200mg组织块，冰浴条件下充分匀浆，离心后取上清液，检测SOD和GSH-PX的活性以及MDA和NO的含量。结果发现，与对照组相比，急性低氧组动物脑组织MDA和NO含量显著增加，SOD和GSH-PX活性下降，预防给药甲苯磺烷唑胺可显著降低急性低氧脑损伤时MDA和NO含量，增加SOD和GSH-PX活性。3.甲苯磺烷唑胺对急性低氧所致AQP-4、VEGF基因表达变化的影响急性低氧组AQP-4和VEGF的mRNA表达显著升高（P＜0.01），预防给予醋氮酰胺和甲苯磺烷唑胺的3个用药组均能使其得到明显改善，表明甲苯磺烷唑胺可通过影响脑中AQP-4和VEGF的表达来调节脑水平衡，而缓解低氧脑损伤的程度。结论1、玉树抗震救灾行动表明，大规模急进高原地区急性高原反应发病率较高，空运和上呼吸道感染是急进高原地区抗震救灾人员急性高原反应发病率的主要影响因素,应提前予以预防和药物干预。2、预防给药甲苯磺烷唑胺5d，6.25mg/(kg·d)以上剂量可以提高密闭缺氧条件下机体缺氧耐力，量效关系明显，其效价优于醋氮酰胺，是后者的16倍；预防给药甲苯磺烷唑胺5d，50和100mg/(kg·d)剂量可以提高急性减压低氧条件下机体缺氧耐力，效果优于醋氮酰胺。甲苯磺烷唑胺可显著抑制肾组织碳酸酐酶Ⅱ的活性，促进碳酸氢盐从尿中排泄，从而致轻度代谢性酸中毒，有助于减轻因过度通气所致呼吸性碱中毒对肺通气的抑制。我们还发现，甲苯磺烷唑胺能显著抑制脑组织碳酸酐酶Ⅱ的活性，可能与减少跟急性高原病有关的脑脊液生成密切相关。甲苯磺烷唑胺具有显著的利尿作用，其利尿作用的机理可与抑制肾的碳酸酐酶有关。据此，我们推测甲苯磺烷唑胺提高机体缺氧耐力的可能机制与其抑制组织碳酸酐酶活性和利尿作用密切相关。3、甲苯磺烷唑胺可显著减轻急性低氧大鼠大脑皮质的水肿程度，可抑制急性低氧时血脑屏障通透性的增加，改善高原急性低氧特殊环境的脑功能，其作用机制与甲苯磺烷唑胺减少氧自由基生成及提高抗氧化酶的活性，以及调节AQP-4和VEGF的表达有关。

全文目录

缩写与略  5-6
中文摘要  6-12
英文摘要  12-18
前言  18-21
  参考文献  20-21
第一部分高原抗震救灾部队急性高原反应发病率及其影响因素  21-31
  第一章高原抗震救灾部队急性高原反应发病率的现场调查  21-25
    1 研究对象  21
    2 调查方法  21-24
    参考文献  24-25
  第二章高原抗震救灾部队急性高原反应发病率的影响因素分析  25-31
    1 人口学及相关暴露因素基本特征  25
    2 急性高原反应发病率及症状学特征  25
    3 影响因素分析  25-28
    4 讨论  28-29
    参考文献  29-31
第二部分靶向性创新药物提高机体缺氧耐力的作用及其机制  31-61
  第一章甲苯磺烷唑胺提高机体整体水平缺氧耐力的作用及其机制  31-45
    第一节甲苯磺烷唑胺提高机体整体水平缺氧耐力的作用  31-37
      1 材料与方法  31-33
      2 结果  33-35
      3 讨论  35-37
    第二节甲苯磺烷唑胺提高机体整体水平缺氧耐力的可能机制  37-43
      1 材料与方法  37-40
      2 结果  40-42
      3 讨论  42-43
    参考文献  43-45
  第二章甲苯磺烷唑胺对急性缺氧所致脑损伤的干预作用及其机制  45-61
    第一节甲苯磺烷唑胺对急性缺氧所致脑损伤的干预作用  45-50
      1 材料与方法  45-47
      2 结果  47-49
      3 讨论  49-50
    第二节甲苯磺烷唑胺对急性缺氧所致脑损伤的干预作用的可能机制  50-59
      1 材料和方法  50-52
      2 结果  52-57
      3 讨论  57-59
    参考文献  59-61
发表文章  61-65
综述  65-72
  参考文献  70-72
个人简历  72-73
致谢  73-74

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