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P53在辐射致DNA损伤反应中的染色质重塑功能研究

作　者: 秦夏
导　师: 周平坤
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: PIG3 P53 染色质重塑 DNA损伤修复微球核酸酶
分类号: R818
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在真核生物中,基因组DNA都是以高度包装的染色质形式存在,这就对基因在转录、复制、修复、重组时相关因子有效地接近DNA形成了天然的屏障,执行上述生理功能需要松散染色质的结构。染色质松散是染色质动态变化即染色质重塑(chromatin remodeling)的重要环节。越来越多的证据表明,染色质重塑在DNA损伤反应中起着非常重要的作用。在细胞DNA损伤反应(DNA damage response, DDR)中,通过染色质重塑可以开放DNA损伤位点,使DNA修复蛋白募集到DNA损伤位点,从而执行和完成修复功能,维持基因组的稳定性。DNA损伤反应过程中的染色质重塑作用和机制研究在最近几年才开始受到关注,由于受到研究技术手段的限制,这方面的信息还不是很多,而且染色质重塑与DNA损伤修复之间的偶联关系与内在机制知之更少。为了深入、直观地研究染色质重塑的分子机制,本研究通过引进并改进一种基于Lac阻遏子和Lac操纵子的大规模染色质重塑报告系统,可以直观地观察靶基因诱导的染色质重塑的时间动力学和强度。本研究的主要目的是探讨DNA损伤修复与染色质重塑之间的偶联机制,并通过大规模染色质重塑报告系统寻找潜在的参与染色质重塑功能的DNA损伤修复反应蛋白,包括P53蛋白、p53诱导基因3蛋白PIG3 (p53-inducible gene 3)等。转录因子P53作为一个重要的抑癌基因,在细胞损伤应答中可诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡、细胞分化以及DNA损伤修复等,以维持基因组的稳定性,被誉为“基因组的守护者”。在一系列交错复杂的DNA损伤应答通路中,P53对靶基因的转录激活是其发挥功能的重要方式;另外,细胞在应激状态下,P53的翻译后修饰对于其执行不同的生物学功能有着重要意义。基于P53在DNA损伤修复调控网络中的核心地位,本研究将从染色质大规模重塑这个全新的角度来寻找P53参与DNA损伤修复的证据并进一步探讨DNA损伤修复与染色质重塑之间的偶联机制。作为p53诱发表达上调的靶基因之一,PIG3 (p53-inducible gene 3)参与了细胞早期凋亡反应,同时在DNA辐射损伤的早期应答中发挥重要功能。那么,PIG3在DNA辐射损伤后是否也参与到染色质的大规模重塑呢?这也是本研究要回答的问题之一。本实验建立了一种便捷实用且易于观察和分析的大规模染色质重塑荧光显微检测技术。该技术的原理是借助将256个Lac操纵子插入到DG44 CHO细胞中的基因组中建立的AO3-1细胞株,通过基因共扩增可产生一个大概90Mb的异染色质区域。我们将要检测的目的基因与Lac阻遏子(LacR)及荧光蛋白GFP融合,该质粒转染AO3-1细胞后,表达融合蛋白,其中GFP会发出绿色荧光。基于LacR识别并结合Lac操纵基因的原理,融合蛋白可以靶向到细胞的异染色质区,在激光共聚焦显微镜下直接观察荧光斑点面积的大小。如果目的基因表达产物具有松驰染色质的功能,荧光斑点就相应扩展。因此,通过测算斑点面积就可判断目的基因是否能够诱导包括Lac操纵基因在内的大尺度染色质松散(荧光点面积的大小与染色质松散的程度正相关)。本论文是基于上述技术路线和实验室前期的工作基础,围绕DNA损伤修复研究方向开展的研究,取得了如下的实验进展:(1)用4Gyγ射线分别照射P53野生型的A549细胞和P53缺陷型的H1299细胞,发现辐射损伤后PIG3 (p53-inducible gene 3)的诱导表达只发生在A549细胞,而未发生在H1299细胞。说明电离辐射对PIG3的表达上调是依赖P53基因的功能。同时,PIG3在H1299细胞中有一定的基础表达水平,说明其基础性表达是不依赖P53功能的。(2)基于大规模染色质重塑荧光显微观察技术,构建LacR-PIG3-GFP重组质粒,转染AO3-1细胞,转染后通过激光共聚焦显微镜观察发现,PIG3在正常情况下并未展现出大规模染色质重塑功能,但在10Gyγ射线照射后则能够一定程度地诱导染色质的大尺度松散。提示其在DNA损伤修复与染色质大规模重塑之间发挥一定的偶联作用。(3)通过大规模染色质重塑报告系统对P53基因进行研究发现:P53在正常及辐射损伤情况下都能够诱导染色质的大尺度松散,特别是在辐射损伤后其诱导染色质重塑的功能更加明显。深入研究发现,乙酰转移酶抑制剂漆树酸和DNA-PKcs的特异抑制剂Nu7026能显著抑制P53介导的大规模染色质重塑。微球核酸酶(MNase)消化实验同样证明了P53参与到DNA损伤反应中的大规模染色质重塑。(4)通过定点突变实验,进一步明确了P53第46位丝氨酸位点S46能够抑制P53诱导大规模染色质重塑的活性,而S15,S37,S20,K120位点都能够增强P53诱导大规模染色质重塑的活性。在这其中,K120是乙酰化位点,其余的是磷酸化位点。在本研究中,我们着重探讨了染色质重塑在DNA损伤修复反应中的功能机制,并首次证明了P53直接参与到了染色质大规模重塑反应中。

全文目录

英文缩略词表  4-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-14
第一章电离辐射诱导PIG3 基因表达依赖于P53 功能  14-21
  1 材料与方法  15-17
  2 结果  17-18
  3 讨论  18-19
  参考文献  19-21
第二章 PIG3 在辐射致DNA 损伤反应中的染色质重塑功能研究  21-28
  1 材料与方法  22-24
  2 结果  24-26
  3 讨论  26-27
  参考文献  27-28
第三章 P53 在辐射致DNA 损伤反应中的染色质重塑功能研究  28-46
  1 材料与方法  30-35
  2 结果  35-42
  3 讨论  42-44
  参考文献  44-46
总结  46-47
综述  47-55
  参考文献  53-55
个人简历  55-56
致谢  56

P53在辐射致DNA损伤反应中的染色质重塑功能研究

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