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探讨酵母Tra1蛋白突变影响基因表达的作用机制

作　者: 张鹏
导　师: 黄国俊
学　校: 南昌大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Tral蛋白 染色质重塑复合物 免疫共沉淀 芯片
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


Tral蛋白是酵母染色质重塑复合物SAGA、NuA4的唯一共有亚基,同时它也是多种转录激活子的直接作用目标,参与了细胞内大量的生理进程。Tral蛋白可能通过三种方式影响转录,包括影响Tral蛋白直接招募到目的基因启动子,染色质重塑复合物SAGA和NuA4完整性和稳定性,影响对组蛋白修饰。本课题利用实验室前期构建的Tral突变菌株Tral-1、Tral-2分两个方面来探讨Tral突变是如何影响基因表达的作用机制。一方面我们利用免疫共沉淀来检测Tral突变是否影响染色质重塑复合物SAGA和NuA4的完整性和稳定性。另一方面我们通过比较不同Tral突变菌种在半致死温度下稳定生长状态下和由宽松生长温度下瞬间转移到严谨温度后30min的芯片结果来分析哪些基因是包含Tral复合物的直接作用的靶基因,哪些是由于级联效应引发的。免疫共沉淀结果显示Tral突变影响了SAGA和NuA4的完整性和稳定性,而且Tral-2影响的程度较Tral-1更严重。microarray结果显示Tral突变主要影响到核糖体相关基因和一些能量代谢途径,而这些结果的获得对进一步系统地分析Tral的功能有重要意义。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
第1章 引言  8-13
  1.1 酵母Tra1蛋白结构及其功能  8-10
  1.2 染色质重塑复合体SAGA与NuA4  10-12
    1.2.1 染色质重塑复合体SAGA  10-11
    1.2.2 染色质重塑复合体NuA4  11-12
  1.3 本课题研究的目的及意义  12-13
第2章 材料与方法  13-37
  2.1 实验材料  13-20
    2.1.1 菌种  13
    2.1.2 质粒  13-15
    2.1.3 引物序列  15
    2.1.4 酶及化学试剂  15
    2.1.5 主要仪器设备  15
    2.1.6 培养基  15-20
    2.1.7 抗体  20
  2.2 实验方法  20-37
    2.2.1 提取酵母基因组DNA  20-21
    2.2.2 引物设计与PCR扩增  21-22
    2.2.3 DNA产物纯化试剂盒  22-23
    2.2.4 酶切体系(TaKaRa)  23
    2.2.5 酶连体系(TaKaRa)  23-24
    2.2.6 质粒DNA的提取  24
    2.2.7 DH5α感受态细胞的制备与转化  24-25
    2.2.8 酵母转化  25-27
    2.2.9 酵母菌落PCR  27
    2.2.10 酵母总RNA的抽提  27-28
    2.2.11 RNA变性电泳  28
    2.2.12 Northern blot  28-30
    2.2.13 Western blot  30-33
    2.2.14 免疫共沉淀  33-34
    2.2.15 抗体制备  34-37
第3章 结果与分析  37-49
  3.1 染色质重塑复合体SAGA亚基Ada2和Spt7加(myc)_(13)标签  37-39
  3.2 部分抗体制备  39-42
    3.2.1 酵母RPL36B抗体制备  39-40
    3.2.2 酵母SAGA复合体组分蛋白spt3、ada5、taf90兔多克隆抗体制备  40-41
    3.2.3 酵母NuA4复合体组分蛋白Eaf1、RNA聚合酶Ⅰ亚基Rpa135兔多克隆抗体制备  41-42
  3.3 温度对Tra1蛋白突变菌株生长的影响  42-46
    3.3.1 Spotting assay测定不同温度下Tra1野生型和突变型菌株的生长表型  43-44
    3.3.2 测定温度转变条件下Tra1野生型和突变型菌株的生长曲线  44
    3.3.3 温度转变后不同时间Tra1野生型和突变型菌株总RNA的抽提  44-45
    3.3.4 northern检测温度转变后不同时间对Tra1野生型和突变型菌株rRNA的影响  45-46
    3.3.5 芯片分析Tra1突变直接影响的靶基因  46
  3.4 Tra1蛋白突变对SAGA和NuA4复合物稳定性的影响  46-49
    3.4.1 部分酵母蛋白抗体效价及蛋白标签添加的检测  47-48
    3.4.2 免疫共沉淀检测Tra1突变对SAGA、NuA4复合体稳定性的影响  48-49
第4章 总结与展望  49-51
致谢  51-52
参考文献  52-57
攻读学位期间的研究成果  57

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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