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腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因抑制PVR的研究

作　者: 袁志刚
导　师: 颜华
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 腺病毒 增生性玻璃体视网膜病变 p21WAF1/CIP1基因 基因治疗 转染
分类号: R774.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的通过建立兔增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)动物模型,探讨腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因对PVR增生的抑制作用及机制,评价其治疗PVR的效果。方法1.PVR动物模型的建立：青紫蓝兔28只,随机分成两组,实验组及对照组各14只。实验组采用玻璃体腔注射人富含血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)联合巩膜外冷冻建立PVR模型,对照组采用玻璃体腔注射兔PRP建立PVR模型。行间接眼底镜、B型超声及HE染色检查,观察PVR程度及视网膜脱离的发生情况。2.p21WAF1/CIP1在PVR发病机制中的作用：青紫蓝兔27只,随机分成两组,正常组3只,实验组24只。正常组不做任何处理；实验组每只兔随机选取一只眼作为实验眼,采用玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻建立PVR模型。行蛋白免疫印迹(Western blot, WB)和逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR),检测PVR模型建立后第7d、14d、21d及28d视网膜组织中p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA的表达。3.体外实验：体外培养hRPE407细胞,细胞同步化后,分为磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)组、阴性对照(adenovirus mediated delivery of non-target control, Ad-NC)组和腺病毒p21WAF1/CIP1载体转染(adenovirus mediated delivery of p21WAF1/CIP1, Ad-p21)组。行WB和RT-PCR检测p21WAF1/CIP1、CDK、cyclin E蛋白及mRNA在细胞中的表达；行3-甲基-2-噻唑硫酮(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)试验、流式细胞仪及Transwell检查。4.体内实验：青紫蓝兔50只,随机分成4组,正常对照组2只,PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组各16只。其中PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组按照前述方法建立PVR模型。正常组不做任何处理,PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组于建模后第7d玻璃体腔分别注入PBS、Ad-NC及Ad-p215ul。第14d时,行WB和RT-PCR检测p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA在视网膜组织中的表达。行间接眼底镜、B型超声及HE染色,观察第28d各组PVR程度及视网膜脱离的发生情况。结果1.建模后观察28d,实验组20眼均发生了视网膜脱离,发生率为100%；对照组,13眼发生了视网膜脱离,发生率为65%,两组差异有统计学意义(P<0.01)。2. WB和RT-PCR检测结果显示,PVR模型建立后7d、14d、21d及28d视网膜组织内p21WAF1/CIP蛋白及mRNA表达水平均低于正常组,第14d时表达最低(P<0.01),而CDK2、cyclin E表达均高于正常组,在第14d时表达水平最高(P<0.01)3.WB和RT-PCR检测结果显示在Ad-p21组,p21WAF1/CIP蛋白和mRNA的表达均增高,说明腺病毒成功介导p21WAF1/CIP基因转染人视网膜色素上皮细胞,并稳定表达。MTT检测细胞转染p21WAF1/CIP基因48h后其增生抑制率达到43.13%,较其它组细胞生长速度减慢。细胞周期检测结果显示,Ad-p21组处于G0/G1期的细胞所占百分比显著高于PBS及Ad-NC组(P<0.01)。Transwell小室检测结果显示Ad-p21组穿膜细胞数,明显低于PBS及Ad-NC组(P<0.01)。4.间接眼底镜及B超结果显示PBS组、Ad-NC组及Ad-p21组第28d视网膜脱离的发生率分别为100%、91.67%和33.33%。建模后第14d时,WB和RT-PCR显示Ad-p21组p21WAF1/CIP1蛋白及mRNA的表达显著高于正常组、PBS组及Ad-NC组(P<0.01),而CDK2、cyclin E表达明显低于其它组(P<0.01)。结论1.采用玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻可成功建立了PVR动物模型,视网膜脱离的发生率为100%。2.p21WAF1/CIP1基因在PVR发病机制中可能起着重要作用。3.腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因能有效抑制人视网膜色素上皮细胞的增生及迁移。4.腺病毒介导p21WAF1/CIP1基因可有效减轻PVR程度,并降低视网膜脱离发生率。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-12
缩略语  12-14
前言  14-17
  研究现状、成果  14-16
  研究目的、方法  16-17
一、PVR动物模型的建立  17-29
  1.1 对象和方法  17-19
    1.1.1 对象  17-18
    1.1.2 方法  18-19
  1.2 结果  19-24
    1.2.1 眼科检查结果  19-20
    1.2.2 眼科B超结果  20-21
    1.2.3 PVR分级  21-22
    1.2.4 组织病理学检查  22-24
  1.3 讨论  24-28
    1.3.1 PVR的基本病理过程和分期  24-25
    1.3.2 常见PVR动物模型的建立方法  25-27
    1.3.3 玻璃体腔注射人PRP联合巩膜外冷冻建立兔PVR模型  27-28
  1.4 小结  28-29
二、p21~(WAF1/CIP1)在PVR发病中作用机制的研究  29-48
  2.1 对象和方法  29-39
    2.1.1 对象  29-31
    2.1.2 方法  31-39
  2.2 结果  39-43
    2.2.1 WB方法检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK2、cyclin E蛋白表达  39-40
    2.2.2 RT-PCR法检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E mRNA的表达  40-43
  2.3 讨论  43-47
    2.3.1 细胞因子在PVR发病中的作用  43-44
    2.3.2 细胞周期及其调控机制  44-45
    2.3.3 p21~(WAF1/CIP1)的生物学功能  45-46
    2.3.4 p21~(WAF1/CIP1)在PVR发病机制中的作用  46-47
  2.4 小结  47-48
三、腺病毒介导外源性p21~(WAF1/CIP1)基因抑制体外培养hRPE细胞增殖及迁移  48-62
  3.1 对象和方法  48-51
    3.1.1 对象  48-49
    3.1.2 方法  49-51
  3.2 结果  51-56
    3.2.1 p21~(WAF1/CIP1)基因转染人视网膜色素上皮细胞形态及数目的影响  52
    3.2.2 MTT法检测细胞增殖  52-53
    3.2.3 Transwell检测细胞迁移  53-54
    3.2.4 流式细胞仪检测细胞周期  54-55
    3.2.5 WB法检测p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E蛋白的表达  55-56
    3.2.6 RT-PCR方法检测p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E mRNA的表达  56
  3.3 讨论  56-61
    3.3.1 RPE细胞在PVR发病中的作用研究  56-58
    3.3.2 p21~(WAF1/CIP1)基因对hRPE细胞增殖及迁移能力的影响  58-59
    3.3.3 腺病毒转染p21~(WAF1/CIP1)基因对hRPE细胞周期调控的机制  59-61
  3.4 小结  61-62
四、腺病毒介导p21~(WAF1/CIP1)基因抑制兔PVR的实验研究  62-73
  4.1 对象和方法  62-65
    4.1.1 对象  62-64
    4.1.2 方法  64-65
  4.2 结果  65-68
    4.2.1 临床观察结果及PVR分级  65-66
    4.2.2 标本大体观察及病理结果  66-67
    4.2.3 WB及RT-PCR检测视网膜p21~(WAF1/CIP1)、CDK_2、cyclin E表达  67-68
  4.3 讨论  68-72
    4.3.1 腺病毒介导堆因转染技术在眼部疾病中的应用  68-69
    4.3.2 增生性玻璃体视网膜病变的治疗现状  69-71
    4.3.3 腺病毒介导p21~(WAF1/CIP1)基因对PVR的抑制作用  71-72
  4.4 小结  72-73
全文结论  73-75
论文创新点  75-76
参考文献  76-87
发表论文和参加科研情况说明  87-88
综述  88-106
  综述参考文献  99-106
致谢  106

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 视网膜及视神经疾病 > 视网膜疾病
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