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RNAi抑制S100A4表达对胰腺癌细胞增殖和迁移的影响

作　者: 刘丽卉
导　师: 陈肖华
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 放射医学
关键词: 钙结合蛋白S100A4 RNAi 增殖 凋亡 迁移和侵袭
分类号: R735.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


胰腺癌是一种恶性程度高、预后差的恶性肿瘤。由于胰腺癌早期无特异性临床症状，发现时大部分已属中、晚期，5年生存率仅为1%～5%。近年来，胰腺癌发病率呈逐年上升趋势，由于其晚期治疗效果差，早期诊断可使更多患者获得手术切除的机会而提高其生存率。然而，现有的影像学检查技术尚不能达到早期诊断的目的，胰腺癌相关的血清学标志物尚不能准确反应肿瘤的发生、发展情况。随着分子生物学的迅速发展，特别是DNA重组技术等的应用，与胰腺癌相关的新的癌基因和抑癌基因不断被克隆和发现，为胰腺癌的发病机制探讨、诊断和治疗提供了许多新的靶点。因此，针对在胰腺癌中高表达的S100A4基因，利用RNAi技术，对其在胰腺癌细胞株BxPc-3中对增殖、凋亡以及迁移和侵袭能力的影响进行详细的探讨，为胰腺癌的临床早期诊断和预后评估提供理论基础。RNA干扰（RNAi）技术是生物体内由具有同源性的双链RNA（dsRNA）介导的序列特异性转录后基因沉默过程。其特征主要表现在：RNAi是siRNA介导的转录后水平的基因沉默，这种作用是针对靶向基因的外显子序列，而对其启动子或内含子序列没有效应，具有高特异性，高效性和高稳定性。目前RNAi已广泛应用于肿瘤的发生发展、侵袭与转移、细胞周期调控、信号传导通路、抗凋亡基因、对放疗化疗敏感性等多方面的研究。S100蛋白是一类小分子量（9 ~ 13）×103的酸性蛋白，因其在100%饱和硫酸铵溶液中能溶解而得名，它是Ca2+结合蛋白家族中最大的亚类。该类蛋白具有两个EF手型结构，末端序列较短。EF手型结构由与Ca2+选择性和高亲和性结合的螺旋-环-螺旋组成，两侧的螺旋结构为疏水区，中间为铰链区。S100蛋白通常以非共价键结合的同源二聚体形式存在，这也是其发挥生物学功能的重要形式。S100A4（S100 calcium binding protein A4）也叫18A2、mts1(metastasin)、CAPL(calcium protein placental homolog)、PEL-98、42A和p9Ka，是S100蛋白家族中最具特征的成员之一。S100A4蛋白以非共价结合的二聚体形式存在于细胞内，而以共价结合的二聚体形式分泌到胞外。研究发现，S100A4能引起肿瘤血管的发生，在肿瘤的发生和转移中发挥重要作用。S100A4蛋白在许多肿瘤细胞中都呈高表达，而这种高表达与乳腺癌、前列腺癌和结肠癌的转移具有非常密切的关系。S100A4是由101个氨基酸组成的多肽，属于Ca2+结合蛋白超家族中的一员，通过与Ca2+结合在肿瘤发生发展中发挥重要作用。它在多种肿瘤细胞中都呈高表达，在肿瘤的生长、侵袭和迁移过程中发挥重要作用，是一个与细胞周期、增殖、凋亡、侵袭转移密切相关的蛋白。在本论文中，进行了以下研究：一、S100A4干涉片段的设计以及干涉效果的验证运用RT-PCR技术鉴定S100A4基因在胰腺癌BxPc-3细胞株中的表达水平,结果显示，S100A4基因在BxPc-3细胞株中具有高表达。查阅Genebank基因库人类S100A4基因全序列，按照siRNA序列的设计原则，设计并合成S100A4-siRNA干涉序列3对及阴性对照序列，经Western Blot验证，S100A4 siRNA174干涉效果最好。经Western Blot和Real-Time PCR实验验证表明：与对照组相比，处理组细胞靶蛋白和靶mRNA表达水平都有明显的降低，干涉效果明显。同样说明RNA干扰技术具有特异性和高效性。二、RNAi抑制S100A4表达对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响克隆形成率是衡量细胞状态和增殖能力的金标准。本实验就应用克隆形成率实验检测其增殖情况并用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。实验分三组：untreated组、NC siRNA组和S100A4 siRNA组。经克隆形成率实验验证，结果发现转染了S100A4-siRNA组的克隆形成率显著降低（P<0.05），提示S100A4基因沉默后细胞增殖受到了抑制。利用流式细胞仪对三组细胞在24h，48h，72h的凋亡情况测试后进行比较，发现各组细胞凋亡情况均无统计学意义，说明S100A4被抑制之后对BxPc-3细胞的凋亡无影响。三、RNAi抑制S100A4表达对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响本实验应用Transwell小室模型来观测其迁移和侵袭能力，Transwell小室是根据上下两个小室，中间隔有一层通透性的膜，依靠两室之间的浓度差来使细胞迁移，由此比较各组细胞的迁移和侵袭能力。实验分三组：untreated组、NC siRNA组和S100A4 siRNA组。结果显示转染了S100A4-siRNA的处理组穿膜细胞数明显少于未转染组和转染阴性对照序列组（P<0.05），说明转染S100A4-siRNA后BxPc-3细胞的迁移和侵袭能力受到抑制。本研究的创新之处在于：利用在肿瘤组织高表达，而正常组织表达较低的钙离子结合蛋白S100A4为靶点，运用RNAi技术，对其在胰腺癌细胞株BxPc-3细胞中对其增殖、凋亡以及迁移和侵袭能力的影响进行详细的探讨，为胰腺癌的临床早期诊断和预后评估提供理论基础，也为癌症的治疗提供新的有效的靶标，给广大癌症患者带来福音。

全文目录


英文缩略词表  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
主要仪器设备  11-12
前言  12-18
第一部分 S100A4 siRNA 干涉序列设计及效果验证  18-30
  1 材料  18-21
  2 方法  21-26
  3 结果  26-28
  4 小结  28-30
第二部分 RNAi 抑制S100A4 表达对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响  30-36
  1 材料  30
  2 方法  30-31
  3 结果  31-34
  4 小结  34-36
第三部分 RNAi 抑制S100A4 表达对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响  36-40
  1 材料  36
  2 方法  36-37
  3 结果  37-39
  4 小结  39-40
讨论  40-42
结论  42-44
参考文献  44-48
文献综述  48-56
  参考文献  53-56
发表文章  56-64
个人简历  64-65
在读期间参与发表文章  65-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 胰腺肿瘤
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