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小檗碱胆酸衍生物B4诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡机制

作　者: 张黎
导　师: 李庆勇
学　校: 东北林业大学
专　业: 药物化学
关键词: 小檗碱胆酸衍生物人肝癌细胞SMMC-7721 凋亡机制活性氧
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

小檗碱对许多肿瘤的生长都有一定的抑制效果,包括肝细胞癌、结肠癌、肺癌、口腔癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等。尽管小檗碱在胃肠道中状态稳定,但是体内吸收不好,导致血药浓度低,生物利用度也不好,影响了对其的有效利用。为了进一步降低小檗碱的毒性,增强机体对其吸收,提高其脂溶性和生物利用度,我们采用亲核取代、酰胺化、酯化等方法将小檗碱与胆酸进行偶联,探索了不同胆酸取代基在小檗碱不同取代位置对其生物活性的影响。研究发现,众多新生衍生物中,通过酯键将鹅脱氧胆酸连接到小檗碱的C-9位上合成出的2,3-Methenedioxy-9-O-(3’a,7’a-dihydroxy-5’β-cholan-24’-propy-lester) berberine (B4),有较高的生物利用度,是小檗碱的4.7倍,同时具有有显著的抗菌活性,对许多肿瘤细胞都具有显著的增值抑制作用,包括肝癌细胞(SMMC-7721, BEL-7402)、胃癌细胞(SGC-7901)、结肠癌(HCT-116)等,其中对肝癌SMMC-7721细胞的外抗肿瘤作用效果最显著,具有良好的开发前景。本论文主要借助细胞平台,运用多种实验手段,包括流式细胞术、激光共聚焦显微镜、琼脂糖凝胶电泳技术以及Western Blot蛋白印记等实验方法研究了B4诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的分子机制。主要研究结果如下：四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测B4对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用以及对人正常肝HL-7702细胞的毒性大小,实验结果表明B4对SMMC-7721细胞的增殖抑制效果明显强于小檗碱,并且呈现一定的时间和浓度上的依赖性；B4对HL-7702正常肝细胞的毒副作用要远小于小檗碱,在0.4μM～2μM实验浓度下,B4对正常细胞的最大抑制率小于20%,毒性很小,因此将2μM作为后续实验的最大给药浓度。观察B4作用SMMC-7721细胞后其形态学特征变化主要是通过激光共聚焦显微镜(LSCM),结果表明2μM B4孵育SMMC-7721细胞48h后,细胞形态发生显著的变化,细胞核缩皱并且边缘化,核仁破碎裂解,产生凋亡小体。通过流式细胞仪分析B4诱导SMMC-7721细胞发生凋亡和对细胞周期阻滞的影响。不同药物浓度处理SMMC-7721细胞48h后,随着给药浓度的增加,处于G0/G1期和G2/M期细胞数不断减少,而S期细胞数不断增加,这表明B4能够诱导SMMC-7721细胞生长周期阻滞于S期。此外凋亡结果显示B4作用SMMC-7721细胞后,随着给药浓度的增加,细胞凋亡率也逐渐增加并且呈现一定的浓度依赖性,但是小檗碱作用后,SMMC-7721细胞的凋亡率却很低,表明B4对人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡诱导作用要显著于小檗碱。流式细胞检测B4诱导SMMC-7721细胞内ROS水平、Ca2+浓度和线粒体膜电位(△ψm)的变化,发现随着给药浓度的增加,细胞内Ca2+、ROS的水平也逐渐增加,细胞△Ψm却逐渐降低。为进一步研究ROS在B4诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中起到的重要作用,我们在B4处理细胞之前,先用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理细胞1h,再用SMMC-7721细胞孵育48h。结果显示在一定的给药浓度范围内,NAC阻止了B4诱导的细胞内Ca2+、ROS水平的升高以及细胞△Ψm的降低,表明ROS能够调控B4诱导的SMMC-7721细胞凋亡。Western Blot法主要分析了B4作用SMMC-7721细胞后常见的凋亡相关蛋白水平的变化,实验结果发现B4能诱导聚ADP-核糖聚合酶(PARP)裂解产物增加以及caspase家族蛋白的活化,同时B4诱导细胞凋亡诱导因子(AIF)蛋白从线粒体易位到胞核,促使核内的DNA大量片段化,这表明B4可能通过激活caspase依赖性和非依赖性的细胞凋亡通路使部分人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。此外,用抗氧化剂NAC抑制活性氧(ROS)的活性后,B4引起的细胞生长抑制、诱导凋亡作用均被减弱,这提示B4诱导SMMC-7721细胞凋亡与细胞内ROS产生增加有关,为进一步将B4应用于肝癌的临床治疗提供一定的依据。该论文的主要研究目的就是通过几种常见的体外实验方法检测B4对SMMC-7721的肿瘤抑制活性,并对其具分子机制做简单研究,最终验证B4通过诱导细胞发生凋亡来实现其抗肿瘤作用,同时证明ROS在此过程中起到了重要的介导和调控的作用。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-16
  1.1 课题背景  10-11
    1.1.1 肝细胞癌概况  10
    1.1.2 抗肿瘤靶向新药的研究进展  10-11
  1.2 小檗碱抗肿瘤活性研究  11-12
  1.3 胆酸的概括  12
  1.4 细胞凋亡  12-15
    1.4.1 细胞凋亡的简介  12
    1.4.2 细胞凋亡的特征  12-14
    1.4.3 细胞凋亡与ROS  14-15
  1.5 立题依据  15-16
2 B4诱导SMMC-7721细胞凋亡研究  16-26
  2.1 实验仪器与材料  16-18
    2.1.1 细胞株  16
    2.1.2 仪器与设备  16
    2.1.3 试剂与材料  16-17
    2.1.4 实验器皿准备  17
    2.1.5 主要试剂的配置  17-18
  2.2 实验方法  18-20
    2.2.1 细胞培养  18
      2.2.1.1 细胞复苏  18
      2.2.1.2 细胞传代  18
      2.2.1.3 细胞冻存  18
    2.2.2 MTT法检测B4的体外肿瘤增值抑制作用  18-19
    2.2.3 B4作用于SMMC-7721细胞形态学观察  19
    2.2.4 DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡  19
    2.2.5 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞早期凋亡  19
    2.2.6 B4对SMMC-7721细胞周期分布的影响  19-20
  2.3 实验结果与讨论  20-24
    2.3.1 B4对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用  20
    2.3.2 B4对人正常肝细胞HL-7702的毒性作用  20-21
    2.3.3 B4诱导SMMC-7721细胞凋亡的形态学变化  21-22
    2.3.4 B4诱导SMMC-7721细胞DNA片段化  22
    2.3.5 B4诱导SMMC-7721细胞凋亡结果  22-23
    2.3.6 B4诱导SMMC-7721细胞周期分布结果  23-24
  2.4 讨论  24-25
  2.5 本章小结  25-26
3 B4诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制研究  26-33
  3.1 实验仪器与材料  26-27
    3.1.1 仪器与设备  26
    3.1.2 试剂与材料  26
    3.1.3 主要试剂配制  26-27
  3.2 实验方法  27-29
    3.2.1 B4对SMMC-7721细胞线粒体膜电位(△Ψm)的影响  27
    3.2.2 B4对SMMC-7721细胞内Ca~(2+)含量的影响  27
    3.2.3 B4对SMMC-7721细胞内ROS含量的影响  27-28
    3.2.4 Western Blot分析B4对SMMC-7721细胞内蛋白表达的影响  28-29
  3.3 实验结果与讨论  29-31
    3.3.1 B4对SMMC-7721细胞中△Ψm的影响结果  29
    3.3.2 B4诱导SMMC-7721细胞内ROS的改变  29-30
    3.3.3 B4诱导SMMC-7721细胞内Ca~(2+)含量变化结果  30-31
    3.3.4 Western-Blot检测结果  31
  3.4 讨论  31-32
  3.5 本章小结  32-33
4 ROS在B4诱导细胞凋亡中的作用研究  33-41
  4.1 实验仪器与材料  33-34
    4.1.1 仪器与设备  33
    4.1.2 试剂与材料  33-34
  4.2 实验方法  34-36
    4.2.1 NAC对B4诱导凋亡时细胞内ROS变化的影响  34
    4.2.2 MTT法检测ROS对细胞增殖变化的影响  34
    4.2.3 ROS对B4诱导凋亡时细胞内△Ψm变化的影响  34
    4.2.4 ROS对B4诱导凋亡时细胞内Ca~(2+)浓度变化的影响  34-35
    4.2.5 Western Blot检测ROS对B4诱导凋亡时蛋白表达变化的影响  35-36
  4.3 实验结果与讨论  36-39
    4.3.1 NAC对B4诱导凋亡时细胞内ROS变化的结果  36
    4.3.2 MTT法检测ROS对细胞增殖变化的结果  36-37
    4.3.3 ROS对B4诱导凋亡时细胞内△Ψm变化的结果  37-38
    4.3.4 ROS对B4诱导凋亡时细胞内Ca~(2+)浓度变化的结果  38-39
    4.3.5 Western Blot检测ROS对B4诱导凋亡时蛋白表达变化的结果  39
  4.4 讨论  39-40
  4.5 本章小结  40-41
结论  41-43
参考文献  43-48
攻读学位期间发表的学术论文  48-49
致谢  49-50

小檗碱胆酸衍生物B4诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡机制

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