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VASN蛋白作为肝癌血清标志物及治疗靶标的研究

作　者: 王玮
导　师: 邵宁生; 李少华
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 指数式富集的配基系统进化 VASN 肿瘤标志物靶标微小RNA
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，据报道，世界范围内每年新增肝细胞癌患者达到700,000以上。中国是全球肝癌发病率最高的国家，有统计显示，我国肝癌发病人数占全球55%，死亡人数占全球45%，列癌症死亡的第二位，而且发病率不断上升。肝细胞癌的早期发现、早期诊断、早期治疗对肝癌患者的预后和存活时间至关重要。甲胎蛋白是迄今人类发现的第一个具有诊断价值的肿瘤标志物，在肝癌普查、早期诊断、疗效判定和预后评价等方面发挥了重要作用。但临床上约有30%～40％肝癌患者血清甲胎蛋白阴性，且近年来又有增多的趋势。这部分肝癌患者缺乏有效的肿瘤标志物用于辅助诊断、预后判断与疗效评价。因此，寻找新的肝癌的血清标志物，尤其与预后相关的标志物具有重要的意义。我们的研究主要基于利用SELEX（SystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialEnrichment）技术发现新的肝癌标志物，并对标志物分子的地位、作用进行了研究，主要分为四个部分：第一部分：肝癌血清标志物的获得与鉴定利用液相SELEX技术，我们实验室以伴肝外转移的AFP（Alpha-fetoprotein）阴性HCC（hepatocellularcarcinoma）患者血清为靶标，以正常人血清为消减靶标，经过5轮结合、消减筛选，获得了特异识别肝癌患者血清的富集ssDNA文库；然后，利用凝胶阻滞的方法，从与富集ssDNA（singlestrandedDNA）文库结合的蛋白中鉴定出候选靶蛋白，VASN（vasorin,slitlike2）蛋白。首先对VASN蛋白在血清标本、肿瘤细胞、肿瘤组织中的表达水平进行了研究，对VASN的标志物地位进行了评价。结果发现肝癌患者血清中的VASN蛋白水平高于正常人，且与AFP无明显相关性，提示VASN可以和AFP联合应用来提高辅助诊断的敏感性。随后，我们检测了肝癌细胞和正常肝细胞中VASNmRNA及蛋白水平，结果显示，VASN水平在肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中较高，在正常肝细胞株HL-7702中较低。Real-timePCR检测VASN在肝癌组织、癌旁组织cDNAarray中的表达水平，结果显示，与正常组织相比，肝癌组织的VASNmRNA水平普遍升高。同样，利用间接免疫荧光实验检测VASN蛋白在肝癌组织切片、良性病变肝组织切片中的表达情况，结果显示，VASN蛋白在肝癌组织中呈高表达，主要表达在癌细胞表面和细胞间隙中；而在肝炎组织中VASN表达水平较低。这些数据均提示VASN可能是肝癌细胞表达并分泌的一个重要分子标志物。第二部分：VASN蛋白作为治疗靶标的初步研究根据我们的工作基础，相关文献报道和生物信息学分析结果，我们推测VASN蛋白可能在肝癌的发生、发展过程中发挥重要作用，因此，我们利用分子生物学技术对VASN的功能进行了探讨。首先，siRNA沉默肝癌细胞中VASN的表达后，MTT实验证实细胞增殖变慢，细胞划痕和Transwell实验均证实细胞迁移变慢，穿膜细胞减少，流式检测发现凋亡细胞增加，免疫印迹实验提示细胞上皮标志蛋白E-cadherin表达增高，间质标志蛋白N-Catenin、Slug表达降低，说明VASN蛋白对肿瘤细胞的增殖、迁移、上皮-间质转化有促进作用，抑制细胞凋亡；单抗抑制实验发现VASN单抗对细胞的增殖也有抑制作用；以上结果提示，作为膜蛋白和/或游离蛋白，VASN可能成为肝癌生物治疗的有效靶标；同时，我们在正常肝细胞株HL-7702中瞬时过表达了VASN蛋白，Real-timePCR、Westernblot检测证实VASN的mRNA、蛋白水平升高，MTT检测提示细胞增殖变快，Transwell实验表明穿膜细胞增多，进一步证实了VASN蛋白的促癌作用。第三部分：肝癌中VASN蛋白水平升高机制的初步探讨生物信息学发现VASN可能是miR-145的靶标。结合我们实验室miR-145的研究基础，即miR-145具有抑癌作用，本论文对miR-145靶向VASN及其生物学作用进行了进一步研究。首先，研究发现在肝癌细胞及正常肝细胞中，VASNmRNA水平与miR-145的水平呈负相关，提示miR-145水平降低可能是导致肝癌中VASN水平升高的原因。通过荧光素酶报告基因，Real-timePCR及Westernblot实验证明了miR-145通过靶向3’UTR（3’UntranslatedRegions）区降低VASN的mRNA水平并导致蛋白水平降低。其次，肝癌细胞中过表达miR-145mimics导致细胞形态发生明显改变，细胞失去伪足样突起同时形状变得不规则，细胞迁移能力下降、增殖变慢，与siRNA沉默VASN后细胞变化一致；共转染miR-145抑制剂能逆转上述变化。因此，我们研究结果表明肝癌细胞株中miR-145低表达是导致VASN高水平的一个重要原因，miR-145通过下调VASN水平，从而发挥其抑癌作用。第四部分：hnRNPA1特异适配子BC15在肝癌中的初步应用研究我室利用组织切片-SELEX技术获得了乳腺癌组织特异结合配基BC15，并鉴定出BC15的靶分子为异质性核内核糖核蛋白A1（heterogeneousnuclearribonucleoproteinA1，hnRNPA1），进一步的研究证实hnRNPA1蛋白在多种癌症的表达都高于癌旁组织，我们重点研究了该蛋白及其适配子BC15在肝癌诊断与治疗中的作用。结果表明，在临床肝癌组织标本中，包括血清AFP阴性的肝癌组织，BC15检测到的hnRNPA1蛋白的表达阳性率明显高于癌旁正常组织和良性病变组织。提示hnRNPA1蛋白和BC15可能成为肝癌患者尤其是血清AFP阴性的肝癌的辅助诊断标志物和分子探针。在正常肝细胞中过表达hnRNPA1能够促进细胞的增殖和迁移，而在肝癌细胞中沉默hnRNPA1的表达以及转染BC15能够有效抑制细胞的增殖和迁移，提示该蛋白在肝癌的发展过程中发挥重要作用，并且是治疗肝癌的一个潜在药物靶点。BC15比siRNA能更有效抑制细胞增殖，为开发细胞内靶标的适配子类药物打开了更广阔的前景。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
第一部分肝癌血清标志物的获得与鉴定  14-37
  前言  14-19
  1.1 实验材料  19-22
  1.2 实验方法  22-28
  1.3 实验结果  28-34
  1.4 讨论  34-37
第二部分 VASN蛋白作为治疗靶标的初步研究  37-61
  前言  37-38
  2.1 实验材料  38-39
  2.2 实验方法  39-45
  2.3 实验结果  45-58
  2.4 讨论  58-61
第三部分肝癌中VASN蛋白水平升高机制的初步探讨  61-71
  前言  61
  3.1 实验材料  61-62
  3.2 实验方法  62-65
  3.3 实验结果  65-69
  3.4 讨论  69-71
第四部分 hnRNPA1特异适配子BC15在肝癌中的初步应用研究  71-80
  前言  71-72
  4.1 实验材料  72-73
  4.2 实验方法  73-74
  4.3 实验结果  74-78
  4.4 讨论  78-80
结论  80-81
参考文献  81-87
致谢  87-89
个人简历  89
发表文章  89-90
综述1  90-101
  参考文献  95-101
综述2  101-109
  参考文献  108-109

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