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血清质谱筛查NSCLC特异性及EGFR-TKI疗效相关性多肽的探索性研究

作　者: 安娟
导　师: 刘晓晴
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 肿瘤学
关键词: 铜离子螯合纳米磁珠基质辅助激光解析电离飞行时间质谱血清多肽图非小细胞肺癌表皮生长因子-络氨酸激酶抑制剂
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景和目的：1.早期诊断是提高肺癌生存率的关键，传统的肺癌诊断技术仍存在一定局限性。鉴于近年来以质谱为核心技术的肿瘤蛋白组学在癌症诊断方面的初步研究，我们探索性应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）患者和健康人群的血清差异多肽，用以建立NSCLC的血清多肽分类模型。2. EGFR基因突变状态是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor—tyrosinekinase inhibitor，EGFR-TKI）疗效的预测因子，因此成为晚期NSCLC个体化治疗的重要检测指标。然而在现实临床工作中，有相当数量的患者由于各种客观条件所限，无法获知EGFR基因突变状态。本研究探索性使用MALDI-TOF-MS对接受EGFR-TKI治疗的晚期NSCLC患者血清标本行质谱分析，期待筛选出可预测疗效的差异蛋白或多肽，从而作为EGFR基因检测的替代或补充。方法：1.将年龄和性别匹配的133例NSCLC患者和132例健康者血清标本按照3:1的比例随机分为两组：训练组由100例NSCLC患者和100例健康者血清标本组成，用以建立分类模型；测试组由33例NSCLC患者和32例健康者血清标本组成，用以验证模型。采用铜离子螯合纳米磁珠（MB-IMAC-Cu2+）提取血清多肽、MALDI-TOF-MS技术检测得到质谱图。ClinProToolsTM(CPT)统计软件分析训练组NSCLC患者与健康者之间的多肽图谱，从中筛选出一组差异多肽并建立分类模型,最后用测试组对模型进行盲样验证。2.收集晚期NSCLC患者接受EGFR-TKI治疗前的血清标本，患者服药4周行影像学检查评价疗效，后每8周随访1次。以PFS为主要研究终点，根据服药后的疗效评价分为疾病控制组和疾病进展组，应用铜离子螯合纳米磁珠提取血清多肽、MALDI-TOF-MS技术对疗前血清进行分析，获取疾病控制组和疾病进展组患者之间的差异多肽并建立分类模型，然后进行盲样验证。秩和检验分析这些建模多肽与EGFR基因表达的相关性。结果：1.在100例NSCLC患者和100例健康者之间观察到血清质荷比（m/z）在800-10,000范围内有131个差异多肽信号峰，在此范围内共得到14个有统计学意义的差异多肽峰(P<0.000,001,AUC≥0.9)，其中NSCLC患者与健康者比较，表达上调的多肽有2个，表达下调的有12个，由统计软件筛选出3个多肽峰（7,478.59Da、2,271.44Da、4,468.38Da）建立分类模型，然后对测试组进行验证，其盲样验证敏感性100%，特异性96.9%，准确率98.5%。2.共有103例接受EGFR-TKI治疗的NSCLC患者纳入统计，按照服药后的疗效评价分为两组：疾病控制组51例，由接受EGFR-TKI后疗效评价CR+PR+SD的患者组成；疾病进展组52例，由疗效PD的患者组成。进一步将血清标本按3:2的比例随机分为两组：训练组由30例疾病控制组和30例疾病进展组患者组成，用以建立分类模型；测试组由21例疾病控制组和22例疾病进展组患者组成，用以验证模型。在30例疾病控制组和30例疾病进展组患者之间观察到血清质荷比（m/z）在800-10,000范围内有125个差异多肽信号峰，在此范围内共得到8个有统计学意义的差异多肽峰（P<0.003,AUC≥0.8），它们在疾病控制组均表达上调，由统计软件筛选出6个多肽峰（2,660.79、3,883.91、3,891.06、4,644.26、7,776.19、9,307.12Da）建立分类模型，然后进行盲样验证，得到敏感性76.2%（16/21），特异性81.8%（18/22），准确率79.1%（34/43）。其中m/z2,660.79、4,644.26、9,307.12三个多肽的表达与EGFR基因突变表达相关（P值分别为0.036、0.025、0.037）。结论：1. NSCLC患者与健康人群的血清多肽存在差异，应用MALDI-TOF-MS技术可建立NSCLC的血清多肽分类模型且小规模验证具有较好的敏感性和特异性,希望大规模验证模型，并与传统诊断方法对照或结合，进而尝试建立一种新的NSCLC早期诊断模式。2.应用MALDI-TOF-MS技术可筛选出一组血清多肽，这些血清多肽的表达与EGFR-TKI疗效正相关，并且m/z2,660.79、4,644.26、9,307.12三个多肽表达与EGFR基因状态具有统计学关联，从而有可能成为预测EGFR-TKI疗效的标记物。

全文目录

缩略词表（按照首字母顺序）  3-8
摘要  8-10
Abstract  10-13
前言  13-15
第一部分 MALDI-TOF 质谱技术在 NSCLC 早期诊断中的应用研究  15-30
  1.1 实验材料  15-17
    1.1.1 试剂  15-16
    1.1.2 实验仪器  16
    1.1.3 实验对象及标本  16-17
  1.2 实验方法  17-20
    1.2.1 血清采集、磁珠提取多肽及质谱检测  17-18
      1.2.1.1 标本收集步骤  17
      1.2.1.2 金属螯合磁珠处理血清样品的步骤  17-18
      1.2.1.3 点靶及质谱检测  18
    1.2.2 分析  18-20
      1.2.2.1 生物信息学软件 ClinProTools 2.1 介绍  18-20
      1.2.2.2 分析过程  20
  1.3 实验结果  20-25
    1.3.1 训练组的血清多肽指纹图谱  20-22
    1.3.2 训练组的血清差异多肽结果分析  22-24
      1.3.2.1 肺癌相关差异表达多肽的发现  22-23
      1.3.2.2 NSCLC 分类模型的建立  23-24
    1.3.3 盲法鉴定  24-25
  1.4 讨论  25-28
  1.5 结论  28
  1.6 参考文献  28-30
第二部分晚期 NSCLC 血清多肽与 EGFR-TKI 疗效的相关性分析  30-46
  2.1 实验材料  30-32
    2.1.1 药物及试剂  30-31
    2.1.2 实验仪器  31
    2.1.3 实验对象及标本  31-32
  2.2 实验方法  32-35
    2.2.1 血清采集、随访、磁珠提取多肽及质谱检测  32-33
      2.2.1.1 标本收集步骤  32
      2.2.1.2 患者随访  32
      2.2.1.3 金属螯合磁珠处理血清样品的步骤  32
      2.2.1.4 点靶及质谱检测  32-33
    2.2.2 分析  33-35
      2.2.2.1 生物信息学软件介绍  33-35
        2.2.2.1.1 ClinProTools 2.1 软件  33-34
        2.2.2.1.2 FlexAnalysis 3.0 软件  34
        2.2.2.1.3 NCBA6.0 软件  34-35
      2.2.2.2 分析过程  35
  2.3 实验结果  35-42
    2.3.1 入组患者临床特征资料  35-36
    2.3.2 NSCLC 患者血清多肽质谱检测结果  36-42
      2.3.2.1 训练组的血清差异多肽结果分析  37-39
        2.3.2.1.1 训练组的血清多肽指纹图谱  37-38
        2.3.2.1.2 疗效相关差异表达多肽的发现  38-39
        2.3.2.1.3 建立模型  39
      2.3.2.2 盲法鉴定  39-41
      2.3.2.3 患者相关临床特征的血清多肽差异分析  41-42
  2.4 讨论  42-44
  2.5 结论  44
  2.6 参考文献  44-46
综述  46-54
  参考文献  51-54
论著  54-68
  参考文献  62-68
个人简历  68-69
致谢  69

血清质谱筛查NSCLC特异性及EGFR-TKI疗效相关性多肽的探索性研究

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