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miR-135a/b在肺癌细胞耐药中的作用及相关机制研究

作　者: 周丽
导　师: 刘平
学　校: 南京医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: miR-135a/b 顺铂耐药 凋亡 MCL1 肺癌
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景与目的：肿瘤耐药的出现是治疗肿瘤的重大障碍，是导致治疗失败的主要原因之一，研究肿瘤细胞耐药性的产生机制和探索逆转耐药的途径是肿瘤研究领域的一个重要方向。肿瘤耐药性可分为原发性耐药（intrinsic resistance）和获得性耐药（acquired resistance），临床常见的恶性肿瘤对化疗的耐药多属获得性耐药，是长期应用药物诱导的结果。目前研究认为，肿瘤原发性耐药与基因遗传学水平的变异密切相关，而肿瘤获得性耐药与基因表观遗传学水平的变异密切相关。表观遗传学不涉及DNA序列改变，主要通过DNA位点甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控三个方面调控相关基因的表达，在肿瘤获得性耐药产生机制中可能发挥重要作用。顺铂（CDDP cisplatin）是非小细胞肺癌（NSCLC）化疗的一线药物，但其获得性耐药制约了其疗效的发挥。microRNA（miRNA）作为表观遗传学的一个重要方面，通过转录后调控机制广泛参与了各种生命活动过程，其中也涉及恶性肿瘤的耐药。近年来研究表明，miRNA可通过靶向调控药物外排泵分子、细胞周期蛋白、凋亡调节蛋白等不同途径介导肿瘤耐药，对异常表达的miRNA进行干预（上调或下调）可改变肿瘤的耐药行为。本研究旨在探索miR-135a/b对肺癌A549/CDDP细胞顺铂耐药的影响及相关机制。方法：（1）分别提取A549和A549/CDDP细胞的总RNA，并进行质检；（2）运用实时荧光定量PCR检测miR-135a/b在A549和A549/CDDP细胞株中的差异表达；（3）探讨miR-135a/b对肺癌细胞株顺铂敏感性的影响：目标miRNA模拟物转染A549/CDDP细胞，目标miRNA抑制物转染A549细胞，分别使miR-135a/b在A549/CDDP细胞中表达增高，而在A549细胞中表达降低，同时分别设立阴性对照组，MTT法检测转染后A549及A549/CDDP细胞对CDDP的敏感性；（4）运用TargetScan、miRBase、miRanda软件预测miR-135a/b可能调控的靶基因，构建MCL1-3’-UTR荧光素酶报告质粒验证MCL1是否为miR-135a/b的靶基因；（5）将目标miRNA模拟物及阴性对照分别转染至A549/CDDP细胞，提取A549细胞及转染后的A549/CDDP细胞总蛋白，运用western blot方法检测转染前后细胞MCL1蛋白的表达差异；（6）流式细胞术检测转染后耐药细胞对顺铂诱导凋亡的影响。结果（：1）实时荧光定量PCR检测结果显示，与母代细胞株A549相比，miR-135a、miR-135b在耐药细胞株A549/CDDP中的表达量均降低，下调倍数分别为：1.66±0.06和5.56±0.09倍。（P<0.05）（2）MTT实验显示，与转染阴性对照片段相比，转染miR-135a/b模拟物后的A549/CDDP细胞明显增加了对CDDP的药物敏感性，IC50值分别为（22±2）、（3.4±1.2）、（4.9±1.9）ug/ml；相反，较转染阴性对照片段而言，在A549细胞中转入miR-135a/b抑制物后，细胞对CDDP的耐药性显著增加，IC50值分别为（9±1.8）、（18±2.1）、（16±1.7）ug/ml。（P<0.05）（3）TargetScan预测MCL1是miR-135a/b的靶基因。在荧光素酶实验中，与对照组相比，实验组MCL1-3’-UTR荧光素酶报告质粒活性显著降低，下调倍数分别为（3.33±0.12）、（2.48±0.09）。（P<0.05）（4）与母代细胞A549相比，MCL1蛋白的表达量在耐药细胞A549/CDDP中明显增加，上调（1.67±0.2）倍。在A549/CDDP细胞中分别转入miR-135a/b模拟物、阴性对照片段后，实验组MCL1蛋白表达量显著低于对照组，下调倍数分别为（2.44±0.04）、（3.22±0.06）倍。（P<0.05）（5）流式细胞仪检测显示，转染miR-135a/b模拟物的实验组对CDDP诱导的凋亡程度（4.05±1.42）、（3.01±1.14）显著高于对照组（0.77±0.21）。（P<0.05）结论：（1）与母代细胞株A549相比，miR-135a、miR-135b在耐药细胞株A549/CDDP中的表达量均降低。（2）过表达miR-135a/b使A549/CDDP细胞对顺铂的敏感性和诱导的凋亡程度明显增加，减轻了肿瘤耐药。（3）miR-135a/b可能通过靶向调控MCL1蛋白表达介导NSCLC细胞的顺铂耐药。

全文目录


中文摘要  5-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-13
材料和方法  13-26
结果  26-35
分析与讨论  35-40
全文小结  40-41
参考文献  41-46
综述  46-59
  参考文献  54-59
攻读学位期间文章发表情况  59-60
致谢  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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