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Vγ9Vδ2T细胞对人急性髓系白血病细胞的杀伤作用及机理研究

作　者: 吴康妮
导　师: 黄河
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: Vγ9Vδ2T细胞急性髓系白血病细胞株原代细胞白血病干细胞杀伤难治耐药机制穿孔素颗粒酶细胞外调节蛋白激酶信号转导酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼浓度
分类号: R733.71
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是成人急性白血病(acute leukemia, AL)最常见的类型。尽管随着化疗方案的改善,AML完全缓解率(complete remission, CR)可达70%左右,仍有约20%的AML患者不能达到CR,属于难治性病例,5年无病生存率极低。而即使初治CR患者大部分也会出现复发,一旦复发,预后差。耐药以及白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)的存在是AML难治及复发的根本原因。目前难治复发AML的治疗仍比较困难,目前难治复发AML的治疗仍比较困难,尚缺乏理想治疗方案。Vγ9Vδ2T细胞是近年来倍受关注的T细胞亚群之一,已证实其具有广泛的特异性抗肿瘤作用。Vγ9Vδ2T细胞杀伤肿瘤不具MHC限制性,容易在体内或体外进行大量扩增,且已在多种晚期实体瘤的临床试验中初步显示出较好的安全性与疗效。基于上述基础,我们推测Vγ9Vδ2T细胞治疗可能为难治复发AML的治疗开辟新的方向。基于以上目的,我们拟解决以下三个科学问题：一、明确Vγ9Vδ2T细胞是否可以在体内外杀伤AML细胞,尤其是难治耐药细胞；二、明确Vγ9Vδ2T细胞识别及杀伤AML细胞以及难治耐药细胞的机制；三、探索联合酪氨酸激酶抑制剂优化对Vγ9Vδ2T细胞体外诱导扩增的合理方案。本研究通过以下三部分研究内容阐明上述科学问题：第一部分：Vγ9Vδ2T细胞对人急性髓系白血病细胞的杀伤作用研究我们首先以AML亚型细胞株Kasumi-1、K562、NB4及HL-60为代表,发现Vγ9Vδ2T细胞对AML细胞的杀伤作用呈效靶比(efficacy to target ratio,E/T)依赖性及时间依赖性增强趋势；Vγ9Vδ2T细胞对不同类型AML细胞的杀伤敏感性存在较大差异：对Kasumi-1细胞株杀伤作用最强,对K562及NB4细胞株杀伤作用中等,对HL-60细胞株杀伤作用极弱；与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokines induced killer cells, CIK)为对照,发现两者对Kasumi-1、K562及NB4细胞的杀伤率无显著统计学差异；为研究Vγ9Vδ2T细胞对难治耐药AML细胞的杀伤作用,我们以P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)高表达的葸环类耐药细胞株K562/AO2、HL-60/ADR及维甲酸受体(retinoic acid receptor, RAR)突变的维甲酸耐药细胞株NB4/R1为代表,发现Vγ9Vδ2T细胞对其杀伤率与其来源的亲本株以及耐药性无明显相关；进一步收集了11例临床难治耐药AML病人的骨髓标本,发现Vγ9Vδ2T细胞对其骨髓原始细胞以及CD34+LSC也具有一定的体外杀伤作用,然而在E/T<200：1时,实际杀伤作用并不显著；以正常骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMC)及正常成纤维细胞为对照,发现Vγ9Vδ2T细胞均无显著杀伤作用；为研究Vγ9Vδ2T细胞对难治耐药AML细胞的体内杀伤作用,我们以K562/AO2耐药细胞株为代表,构建了NOD/SCID小鼠人源化耐药AML模型,发现唑来膦酸和IL-2联合Vγ9Vδ2T细胞治疗组与对照组及单用唑来膦酸和IL-2治疗组比较,体重无明显减轻,肿瘤负荷显著降低,生存时间延长。本部分实验结果表明,Vγ9Vδ2T细胞可在体内外水平杀伤AML细胞,包括难治耐药细胞。Vγ9Vδ2T细胞对耐药细胞的杀伤率与来源的亲本株以及耐药性无明显相关第二部分：Vγ9Vδ2T细胞识别及杀伤人急性髓系白血病细胞的机制研究我们首先以Vγ9Vδ2T细胞杀伤作用最强的Kasumi-1细胞株为研究对象,通过高内涵细胞分析系统观察Vγ9Vδ2T细胞杀伤AML细胞过程的动态行为,发现Vγ9Vδ2T细胞与Kasumi-1共同孵育1h后,Vγ9Vδ2T细胞形态即发生明显变异,伸出伪足,在共同孵育2h后,Vy9Vδ2T细胞上出现捕获Kasumi-1细胞膜的荧光融合信号；流式细胞术分析验证了Vy9Vδ2T细胞捕获Kasumi-1细胞膜现象；共聚焦显微镜观察到两者共同孵育4h后,Kasumi-1细胞呈现典型的凋亡形态。为明确Vγ9Vδ2T细胞杀伤AML细胞的机制,我们将Vy9Vδ2T细胞与Kasumi-1、K562、HL-60细胞株、耐药株K562/AO2以及2例难治耐药AML病人骨髓原始细胞共同孵育4h,发现表达CD107a的Vy9Vδ2T细胞比例显著增加,伴刀球霉素A(Concanamycin A, CMA)阻断CD107a表达后,Vy9Vδ2T细胞的杀伤率明显减低；使用FasL阻断型抗体阻断Fas与FasL作用途径后,Vy9Vδ2T细胞对Kasumi-1及NB4细胞的杀伤率无明显变化；将Vy9Vδ2T细胞与Kasumi-4、NB4细胞株共同孵育8h后发现其培养液上清中分泌型TNF-α (secreted TNF-α, sTNF-α)的水平明显增加,但使用TNF-α阻断型抗体阻断TNF-α与TNF-α受体作用途径后,Vy9Vδ2T细胞对Kasumi-1及NB4细胞的杀伤率无明显变化；将Vy9Vδ2T细胞与K562细胞以及耐药株K562/AO2共同孵育5～20分钟即可有效引起细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)分子磷酸化,对Vy9Vδ2T细胞杀伤作用极弱的HL-60细胞则无明显的ERK磷酸化现象；使用PD98059阻断ERK通路及使用LY294002阻断ERK上游Akt通路后显著减弱Vy9Vδ2T细胞与K562及K562/AO2共同孵育4h后CD107a的表达,对HL-60细胞无显著作用。为进一步了解Vy9Vδ2T细胞识别AML细胞的机制,我们通过阿托伐他汀阻断TCR配体异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)在Kasumi-1、K562、NB4细胞株及耐药株K562/AO2中的合成,发现Vγ9Vδ2T细胞对上述细胞4h杀伤作用明显减低；通过流式细胞术分析发现Vy9V82T细胞表面高表达NKG2D、 CD11a、CD226三个杀伤相关受体分子；NKG2D的配体MICA/B、ULBP-1、ULBP-2、 ULBP-4,CD11a的配体ICAM-1、ICAM-2以及CD226的配体Nectin-2、PVR在上述不同AML细胞株及耐药细胞株中表达水平各异,Kasumi-1细胞表达以上所有相关配体；上述配体的表达在耐药株与其来源的亲本敏感株之间也存在较大差异；通过线性回归模型进行相关性分析发现其中ULBP-4及Nectin-2的表达水平与Vy9Vδ2T细胞对其杀伤作用存在密切相关性；使用阻断型抗体阻断NKG2D后发现Vy9Vδ2T细胞对表达ULBP-4的Kasumi-1细胞株4h杀伤率显著减低；对不／低表达ULBP-4的细胞株K562、NB4及耐药株K562/AO2细胞株无明显变化；阻断CD226后发现Vy9Vδ2T细胞对表达Nectin-2的细胞株Kasumi-1、K562、NB4及耐药株K562/AO2的4h杀伤率均显著减低；阻断CD11a后发现Vy9Vδ2T细胞对表达ICAM-1/2的细胞株Kasumi-1、K562、NB4及耐药株K562/AO2的4h杀伤率大部分无显著变化。本部分实验结果表明,Vy9Vδ2T细胞杀伤AML细胞依赖细胞间直接接触及细胞膜捕获作用,通过激活ERK通路磷酸化,触发穿孔素、颗粒酶作用途径,使靶细胞在4h内发生凋亡。TCR-IPP、NKG2D-ULBP-4及CD226-Nectin-2识别途径可能参与了Vy9V82T细胞对AML细胞的杀伤机制。Vy9V82T细胞的杀伤作用与细胞类型及耐药性无关,与AML细胞表面配体ULBP-4及Nectin-2的表达水平有关。第三部分：联合酪氨酸激酶抑制剂优化Vy9Vδ2T细胞体外诱导扩增方案的合理性研究我们首先检测了临床引起慢粒细胞凋亡IC50浓度及临床血药峰浓度的伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼对Vy9Vδ2T细胞体外诱导扩增效率的影响。发现只有达沙替尼IC50浓度的诱导不仅显著增加了Vy9Vδ2T细胞诱导扩增的数量,同时保持了理想的诱导比例。为明确三种TKI对Vy9Vδ2T细胞增殖活化的影响,我们检测了Vy9Vδ2T细胞表面增殖活化分子CD69、HLA-DR及CD25的表达水平,发现只有达沙替尼IC50浓度可增强Vy9Vδ2T细胞增殖活化分子CD69、HLA-DR的表达,与之前增殖实验的结果一致。CD25分子在各组均无显著差异。我们还检测了Vγ9Vδ2T细胞表面与活化诱导的细胞凋亡有关的分子Fas的表达,发现达沙替尼IC50组及达沙替尼峰浓度组显著下调了Fas的表达水平。由于在以上三种TKI中发现只有达沙替尼在IC50即10nmol/L浓度时可显著增加Vy9Vδ2T细胞的体外诱导扩增效率,而在峰浓度即200nmol/L时反呈抑制作用,表明不同浓度的达沙替尼对Vγ9Vδ2T细胞的体外诱导扩增作用可能有明显差异。为摸索达沙替尼诱导Vγ9Vδ2T细胞体外扩增的最佳方案,我们进一步用浓度梯度的达沙替尼进行Vγ9Vδ2T细胞体外诱导培养,对Vγ9Vδ2T细胞的增殖能力以及对AML细胞的杀伤功能进行系统研究。发现达沙替尼在10nmol/L浓度范围内可促进Vγ9Vδ2T细胞的体外诱导扩增的绝对数量,其中在2umol/L时扩增的数量达到顶峰,而在大于10nmol/L浓度时呈现浓度依赖性的抑制作用；达沙替尼在10nmol/L浓度范围内可维持理想的Vγ9Vδ2T细胞诱导比例,而在大于10nmol/L浓度时呈现浓度依赖性的抑制作用；浓度梯度的达沙替尼诱导后Vγ9Vδ2T细胞的脱颗粒作用均较对照组增强,并且这种增强作用随达沙替尼浓度的增加呈现逐渐降低复上升的趋势；达沙替尼对Vγ9Vδ2T细胞的脱颗粒增强作用可能与增强其CD27-效应型亚群的比例有关,且在较低剂量时主要以诱导CD27-CD45RA-亚群比例增加为主,在较高剂量时以诱导CD27-CD45RA+亚群比例增加为主。本部分实验结果表明,合适剂量范围内的达沙替尼可通过上调增殖活化分子表达增强Vγ9Vδ2T细胞体外诱导的效率,下调Fas表达保持诱导Vγ9Vδ2T细胞的活力,并通过增强其CD27-效应型亚群的比例增强Vγ9Vδ2T细胞对AML细胞的脱颗粒作用,对优化目前Vγ9Vδ2T细胞体外诱导培养方案具有合理性。综上,本研究证实了Vγ9Vδ2T细胞可杀伤AML难治耐药细胞,系统揭示了Vγ9Vδ2T细胞识别及杀伤AML细胞的分子机制,进一步阐明联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼可优化目前Vγ9Vδ2T细胞体外诱导培养的方案。本研究可为难治耐药AML的治疗开辟新的思路,为丰富Vγ9Vδ2T细胞抗肿瘤生物学行为的认识奠定实验基础,并为优化目前Vγ9Vδ2T细胞体外诱导培养方案提供有价值的实验依据。

全文目录

致谢  5-6
前言  6-9
摘要  9-14
ABSTRACT  14-21
缩略语  21-24
目次  24-26
第1章 V_γ9Vδ2T细胞对人急性髓系白血病细胞的杀伤作用研究  26-51
  1.1 引言  26-28
  1.2 材料和方法  28-35
  1.3 结果  35-45
    1.3.1 V_γ9Vδ2T细胞对AML细胞株的体外杀伤作用  35-38
    1.3.2 V_γ9Vδ2T细胞对AML难治耐药细胞的体外杀伤作用  38-42
    1.3.3 V_γ9Vδ2T细胞对AML难治耐药细胞的体内杀伤作用研究  42-45
  1.4 讨论  45-50
  1.5 小结  50-51
第2章 V_γ9Vδ2T细胞识别及杀伤人AML细胞的机制研究  51-87
  2.1 引言  51-52
  2.2 材料和方法  52-63
  2.3 结果  63-81
    2.3.1 V_γ9Vδ2T细胞杀伤AML细胞的机制研究  63-72
    2.3.2 V_γ9Vδ2T细胞识别AML细胞的机制研究  72-81
  2.4 讨论  81-86
  2.5 小结  86-87
第3章联合酪氨酸激酶抑制剂优化V_γ9Vδ2T细胞体外诱导扩增方案的研究  87-114
  3.1 引言  87-89
  3.2 材料和方法  89-91
  3.3 结果  91-108
    3.3.1 伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼对V_γ9Vδ2T细胞诱导扩增效率的影响  91-99
    3.3.2 浓度梯度的达沙替尼对V_γ9Vδ2T细胞诱导扩增效率及对AML细胞杀伤功能的影响及机制  99-108
  3.4 讨论  108-112
  3.5 小结  112-114
总结  114-115
参考文献  115-125
综述 V_γ9Vδ2T细胞生物学特性的研究现状及进展  125-144
  摘要  125-126
  1 V_γ9Vδ2T细胞的免疫调控作用  126-129
  2 V_γ9Vδ2T细胞的免疫监视作用  129-137
  3 结语  137-138
  参考文献  138-144
作者简历及在学期间主要成果  144-147

Vγ9Vδ2T细胞对人急性髓系白血病细胞的杀伤作用及机理研究

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