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miR-26a对小鼠神经元形态发育影响的研究

作　者: 李保国
导　师: 孙晗笑; 焦建伟
学　校: 暨南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: miR-26a PTEN 神经突生长 阿尔茨海默症
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：探讨microRNA-26a (miR-26a)在神经元形态发育过程中发挥的作用及其分子机制研究。方法：1.运用实时荧光定量PCR的方法，检测miR-26a在神经干细胞和神经元细胞中的表达情况。2.用免疫荧光染色和激光共聚焦的方法检测收集神经元细胞图像。3.利用Image-ProPlus软件对神经元细胞形态进行Sholl分析并统计神经元突起的长度和分布。4.利用Targetscan软件对miR-26a进行靶点预测分析。5.在神经元细胞中通过转染miR-26a mimic实现miR-26a的特异性过表达；转染miR-26ainhibitor实现miR-26a的特异性抑制。通过慢病毒感染法实现phosphatase and tensin homolog (PTEN)的特异性过表达；利用PTENshRNA通过small interfering RNA(siRNA)技术实现对PTEN的特异性敲降。并通过蛋白质印迹反应检测PTEN蛋白的表达水平。结果：1.miR-26a在神经元细胞中的表达比在神经干细胞中的表达量要丰富。2.过表达miR-26a组神经元细胞突起的数量、长度和分布较对照组有着明显升高；敲降miR-26a组神经元细胞的突起的数量、长度和分布较对照组有着明显下降（n>100, P<0.05）。3.PTEN信使RNA（mRNA）的3’端非编译区(3’UTR)含有三个与miR-26a特异性结合的位点。4.在神经元细胞中，过表达miR-26a，PTEN蛋白表达水平出现明显下降。过表达PTEN，神经元细胞突起的数量、长度和分布均出现显著性下降；而敲降PTEN，神经元细胞突起的数量、长度和分布均出现显著性上升（n>100, P<0.05）。结论：1.过表达miR-26a能够促进神经元细胞突起的生长，增加神经元细胞突起的数量、长度和分布，表明miR-26a在神经元形态发育过程中发挥着重要的作用。2.在神经元细胞中PTEN是miR-26a的一个关键性作用靶点。3.过表达PTEN基因能够明显抑制神经元细胞的生长发育，降低神经元细胞的可塑性。在神经元细胞中PTEN是介导miR-26a发挥其相关调控作用的关键分子。这些发现让人们对神经元可塑性及其生长有了更进一步的认识，能够为阿尔茨海默症及其相关神经退行性疾病提供一个新的解决思路。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
目录  6-8
主要缩略词表  8-9
前言  9-15
1 miR-26a 在神经元细胞中表达水平的研究  15-24
  1.1 实验材料  15-18
    1.1.1 实验样本  15
    1.1.2 实验试剂和仪器设备  15-18
  1.2 实验方法  18-20
    1.2.1 神经干细胞与神经元细胞的体外分离和培养  18-19
    1.2.2 实时荧光定量 PCR 检测  19-20
  1.3 实验结果与小结  20-24
2 miR-26a 对神经元突起生长影响作用的研究  24-35
  2.1 实验材料  24
    2.1.1 实验材料  24
    2.1.2 实验试剂和仪器设备  24
  2.2 实验方法  24-25
    2.2.1 细胞转染  24
    2.2.2 免疫荧光染色  24-25
    2.2.3 神经元形态分析  25
    2.2.4 细胞凋亡检测：使用 TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒  25
  2.3 实验结果与小结  25-35
3 神经元细胞中 miR-26a 的靶基因验证研究  35-41
  3.1 实验材料  35
    3.1.1 实验材料  35
    3.1.2. 实验试剂和仪器设备  35
  3.2 实验方法  35-37
    3.2.1 蛋白质印迹检测  35-36
    3.2.2 实时荧光定量 PCR 检测  36
    3.2.3 HEK293 细胞培养  36
    3.2.4 对 miR-26a 进行靶标预测并分析其调控通路  36
    3.2.5 萤光素酶报告基因检测  36-37
  3.3 实验结果与小结  37-41
4 PTEN 在神经元细胞中介导 miR-26a 发挥其调控功能的研究  41-59
  4.1 实验材料  41
    4.1.1 实验材料  41
    4.1.2 实验试剂和仪器设备  41
  4.2 实验方法  41-47
    4.2.1 感受态大肠杆菌的制备  41
    4.2.2 转化  41-42
    4.2.3 质粒提取  42
    4.2.4 PTEN 过表达和 PTEN shRNA 慢病毒表达载体的构建  42-46
    4.2.5 慢病毒的包装  46
    4.2.6 病毒滴度的测定和病毒感染  46-47
    4.2.7 免疫荧光染色  47
  4.3 实验结果与小结  47-59
总结与展望  59-62
参考文献  62-71
致谢  71-72

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 精神病学 > 脑器质性精神障碍 > 老年及早老性精神障碍
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