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脑缺血再灌注损伤神经保护策略研究

作　者: 陈娜
导　师: 孙曼霁; 周建平
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 脑缺血再灌注损伤 神经保护 时间窗 联合应用
分类号: R743.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目前，脑血管意外位居世界致死率排行榜的第二位。据我国卫生部统计数据，2009年脑血管病的城市死亡率为126.27/10万，占死亡人数的20.36%，农村为152.09/10万，占23.19%。意外幸存者的致残率也非常高。治疗的选择性小，风险高。对于缺血性脑血管意外，首要的是要恢复其血流供应，其后会发生脑缺血再灌注损伤。在脑缺血再灌注损伤进程的不同阶段起主导作用的可能有氧化损伤机制、免疫炎症机制、神经营养因子学说等，针对这些机制我们选用异丙酚、白介素1受体拮抗剂、PTD-BDNF，研究其对于脑缺血再灌注损伤后神经功能的保护作用，寻找合理的时间窗及神经保护因子组合。异丙酚(2,6-Diisopropylphenol，propofol)是一种静脉麻醉药，具有抗氧化作用。在本研究中用于SH-SY5Y神经细胞缺糖缺氧再给氧模型（oxygen glucosedeprivation，OGD)后48h的流式细胞仪检测显示：异丙酚用药组与模型组比较SH-SY5Y神经细胞存活数量较多,晚期凋亡和死亡细胞减少。在海马细胞的OGD模型也有同样的结果。海马细胞钙成像试验显示异丙酚可以使钙内流延迟出现3-4min。在SD大鼠的大脑中动脉阻断模型（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO)中，对于脑缺血大鼠的死亡率，体重恢复及神经症状改善情况最佳的为中异丙酚组，先异丙酚组次之，后异丙酚的体重恢复及神经症状改善情况与模型组没有统计学差异。中异丙酚组可提高SD大鼠MCAO后对Morris水迷宫的立体空间学习和记忆的能力，先、后异丙酚组不能提高。在随后的实验中，中异丙酚可减少脑梗死体积，HE染色显示异丙酚减少神经元凋亡和坏死，免疫印迹结果显示可增强脑中突触素（synaptophysin，syn）的表达。总之，先、后异丙酚应用对神经细胞保护也有一定程度的作用，但效果不及中异丙酚组明显。白介素1受体拮抗剂（Interleukin-1receptor antagonist，IL-1RA)用于SH-SY5Y神经细胞OGD模型后48h的流式细胞仪检测显示：IL-1RA组与模型组比较SH-SY5Y神经细胞存活数量较多，晚期凋亡和死亡细胞减少，在海马细胞的OGD模型后也有同样结果。在不同时间点向细胞培养皿中加入IL-1RA均可以引起突触素的表达，增加GAP-43的表达。在MCAO模型，前IL-1RA组对MCAO大鼠死亡率改善不明显，中IL-1RA组可使死亡率较模型组明显降低，改善其体重恢复及神经症状，后IL-1RA组不仅不能降低死亡率，反而使其升高。。在对中IL-1RA组随后的实验中HE染色显示14天、21天后可以减少神经元凋亡和坏死，免疫组化和免疫印迹均显示可增强脑中突触素的表达。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)与HIV-1反式激活蛋白(trans-activator transcription，TAT)中的蛋白转导区(protein transduc tiondomain， PTD)相连成重组的PTD-BDNF，用于SH-SY5Y神经细胞OGD模型后48h的流式细胞仪检测显示：PTD-BDNF组与模型组比较SH-SY5Y神经细胞存活数量较多，凋亡细胞减少，在海马细胞的OGD模型后也有同样结果。在海马细胞的OGD模型后，PTD-BDNF组与模型组比较细胞状态较好，CCK-8实验显示不同浓度PTD-BDNF可促进OGD后海马细胞的存活，在1-100ng/ml范围内呈浓度依赖性。PTD-BDNF可以使海马细胞突触素的表达增高。在MCAO模型，中、后PTD-BDNF组可使死亡率较模型组明显降低，改善其体重恢复及神经症状，先PTD-BDNF组没有降低死亡率，体重改善与神经症状评分也不及中、后PTD-BDNF组明显。中后PTD-BDNF组可提高SD大鼠MCAO后对Morris水迷宫的立体空间学习和记忆的能力，在随后的实验中，中PTD-BDNF组可以在7天、14天时增加脑中Brdu细胞的数量。免疫印迹显示PTD-BDNF可增强脑中突触素的表达。联合应用不同因子组合实验中，在海马细胞免疫组化实验中，异丙酚联合IL-1RA组突触素表达不明显；异丙酚联合PTD-BDNF组、 PTD-BDNF联合IL-1RA组能明显增强突触素的表达。不同因子组合应用可增强GAP-43的表达。在MCAO大鼠模型中，不同因子组合死亡率、体重恢复及神经症状评分相对于单独应用有进一步的改善效果。本研究表明异丙酚、白介素1受体拮抗剂、PTD-BDNF单独应用均可在细胞的OGD模型，SD大鼠的MCAO模型中显示神经保护作用，时间窗的选择以缺血后再灌注前1小时加入神经保护因子的神经细胞保护作用较好。不同因子组合在动物实验中显示，三种因子的各个组合联用相比单独应用有进一步的改善的作用。本研究为神经保护因子应用时合理的时间窗选择，应用因子组合后对于神经细胞的保护作用提供了实验依据。

全文目录


缩略词表  8-9
摘要  9-11
Abstract  11-14
前言  14-17
第一章 异丙酚对脑缺血再灌注损伤神经元的保护作用及其作用机制研究  17-39
  材料  17-19
  方法  19-26
    1. 溶液配制  19-20
    2. SH-SY5Y神经细胞存活、细胞凋亡测定  20-21
    3. 海马细胞形态观察、细胞凋亡测定  21
    4. 海马细胞钙成像实验  21-22
    5. SD大鼠MCAO模型制作  22-23
    6. MCAO大鼠死亡率、体重测定及神经评分  23-24
    7. 水迷宫实验  24-25
    8. 脑梗塞体积测定  25
    9. 病理组织学观测  25
    10. 免疫印迹检测蛋白表达  25-26
    11. 统计学处理  26
  结果  26-37
    0. 异丙酚减少SH-SY5Y神经细胞OGD后的凋亡率  26-27
    1. 异丙酚对海马细胞OGD后引起的细胞形态变化及细胞凋亡的影响  27-29
    2. 异丙酚延迟海马细胞OGD后的钙内流  29
    3. MCAO模型的建立  29-30
    4. 异丙酚对MCAO后大鼠死亡率的影响  30-31
    5. 异丙酚对MCAO后大鼠体重及神经功能评分的影响  31-32
    6. 异丙酚对MCAO大鼠行为功能的影响  32-34
    7. 异丙酚对MCAO大鼠脑梗塞体积的影响  34-35
    8. 异丙酚对MCAO大鼠病理组织学染色的影响  35
    9. 异丙酚对MCAO大鼠突触素表达的影响  35-37
  讨论  37-39
第二章 IL-1RA对脑缺血再灌注损伤神经元的保护作用及其作用机制研究  39-58
  材料  39-40
  方法  40-42
    1. SH-SY5Y神经细胞存活、细胞凋亡测定  40
    2. 海马细胞形态观察、细胞凋亡测定  40
    3. 海马细胞免疫细胞化学  40-41
    5. MCAO大鼠死亡率、体重测定及神经评分  41
    6. 水迷宫实验  41
    7. 病理组织学观测  41-42
    8. 免疫组织化学检测  42
    9. 免疫印迹检测蛋白表达  42
    10. 统计学处理  42
  结果  42-56
    1. IL-1RA对SH-SY5Y神经细胞OGD引起的细胞凋亡的影响  42-43
    2. IL-1RA对海马细胞OGD后引起的细胞形态变化及细胞凋亡的影响  43-44
    3. IL-1RA对海马细胞钙内流的影响  44-45
    4. IL-1RA对海马细胞OGD后引起的突触素、GAP-43 表达的影响  45-47
    5. IL-1RA对MCAO后大鼠死亡率的影响  47
    6. IL-1RA对MCAO后大鼠体重及神经症状评分的影响  47-49
    7. IL-1RA对MCAO大鼠行为功能的影响  49-50
    8. IL-1RA对MCAO大鼠病理组织学染色的影响  50-52
    9. IL-1RA对MCAO大鼠突触素表达的影响（免疫组化）  52-54
    10. IL-1RA对MCAO大鼠突触素表达的影响(免疫印迹)  54-56
  讨论  56-58
第三章 PTD-BDNF对脑缺血再灌注损伤神经元的保护作用及其作用机制研究  58-75
  材料  59
  方法  59-62
    1. SH-SY5Y神经细胞存活、细胞凋亡测定  59-60
    2. 海马细胞形态观察、细胞凋亡测定  60
    3. 海马细胞钙成像实验  60
    4. 海马细胞免疫细胞化学  60-61
    5. MCAO大鼠死亡率、体重测定及神经评分  61
    6. 水迷宫实验  61
    7. 免疫组织化学检测  61-62
    9. 免疫印迹检测蛋白表达  62
    10. 统计学处理  62
  结果  62-74
    1. PTD-BDNF对SH-SY5Y神经细胞OGD引起的细胞凋亡的影响  62-63
    2. PTD-BDNF对海马细胞OGD后引起的细胞形态变化及细胞凋亡的影响  63-64
    3. PTD-BDNF对OGD后海马细胞钙内流的影响  64-65
    4. PTD-BDNF对海马细胞OGD后引起的突触素、GAP-43 表达的影响  65-67
    5. PTD-BDNF对MCAO后大鼠死亡率的影响  67
    6. PTD-BDNF对MCAO后大鼠体重及神经症状评分的影响  67-69
    7. PTD-BDNF对MCAO大鼠行为功能的影响  69-71
    8. PTD-BDNF对MCAO大鼠Brdu表达的影响  71-72
    9. PTD-BDNF对MCAO大鼠突触素表达的影响  72-74
  讨论  74-75
第四章 不同因子组合用于脑缺血再灌注损伤的神经保护治疗策略初探  75-85
  材料  75-76
  方法  76-77
    1.海马细胞免疫细胞化学  76
    2.MCAO大鼠死亡率、体重测定及神经评分  76-77
    3.统计学处理  77
  结果  77-84
    1. 不同因子组合对海马细胞OGD后引起的突触素、GAP-43 表达的影响  77-81
    2. 不同因子组合对MCAO后大鼠死亡率的影响  81-82
    3. 不同因子组合对MCAO后大鼠体重的影响  82
    4. 不同因子组合对MCAO后大鼠pellotu评分的影响  82-83
    5. 不同因子组合对网屏测验评分的影响  83-84
  讨论  84-85
结论  85-86
参考文献  86-88
综述  88-101
  参考文献  95-101
论著  101-109
个人简历  109-110
致谢  110

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病（中风）
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