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SGEF在前列腺癌进展中的作用和功能研究

作　者: 王洪涛
导　师: 周建光
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 前列腺癌 SGEF 雄激素受体共抑制因子
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤,诊断率和致死率在美国均居第二位,我国近年来前列腺癌的发病率也呈现逐年上升趋势。早期阶段前列腺癌的存活和生长依赖于体内雄激素水平,因此通过双侧睾丸切除手术或药物治疗撤除雄激素是前列腺癌治疗的主要手段,但其疗效作用并不持久,在术后1-3年,几乎所有患者都会发展为雄激素非依赖性前列腺癌,并且最终因癌细胞发生转移而导致患者死亡。目前对于前列腺癌由雄激素依赖型向非依赖型转化的分子机制还不是很明确,因此当前急需解决的科学问题就是阐明前列腺癌雄激素非依赖型转化的分子机制和鉴定出更多发挥作用的蛋白分子以及相关的信号通路。本课题旨在阐明鸟苷酸交换因子家族成员SGEF是否在前列腺癌进展及雄激素非依赖转化中发挥作用,并初步探索其发挥作用的分子机制及其与雄激素受体AR的关系,以期发现与前列腺癌进展相关新的信号通路分子及药物靶标。SGEF是通过筛选前列腺癌细胞中受雄激素调控的效应分子时发现的,位于染色体上经常发生扩增的区域3q25.2,属于典型的Dbl家族RhoGEFs。SGEF除包含典型的GEFs分子上保守的DH-PH结构域外,还包括脯氨酸富集结构域、两个核定位序列和SH3结构域。目前对于SGEF的研究较少,且主要集中在其在细胞骨架调节中的作用,还没有其在前列腺癌进展中作用的相关研究报道。我们首先研究了多种肿瘤细胞系中SGEF的表达谱,发现SGEF在所应用的全部前列腺癌细胞系中均有表达,在部分的肺癌细胞系中有表达,在其它肿瘤细胞系中不表达或表达相对很低,这些结果表明在前列腺癌细胞SGEF具有相对特异性的表达。随后我们在RNA和蛋白水平检测了SGEF在前列腺正常细胞(RWPE-1)、前列腺增生细胞(BPH)、雄激素依赖恶性程度低的前列腺癌细胞系(LNCaP)和雄激素非依赖恶性高的前列腺癌细胞系(C4-2)中的表达水平,发现随着前列腺癌发生发展的恶性进程,SGEF的表达逐渐升高。接下来我们选取了一份包括正常前列腺组织、前列腺增生组织和前列腺癌组织共71例的临床标本进行了免疫组化分析,结果显示在前列腺癌组织SGEF的阳性率远高于前列腺正常组织和增生组织。这些结果在细胞水平和临床水平提示着SGEF有可能具有癌基因的性质。通过MTT实验、平板克隆实验和软琼脂克隆实验我们发现,敲低SGEF的表达能够抑制前列腺癌细胞的生长能力、存活能力和恶性程度。临床标本和Transwell实验的结果显示SGEF能够促进前列腺癌细胞的迁移能力。我们随后对SGEF在前列腺癌雄激素非依赖型生长中的作用进行了研究。我们在完全撤出雄激素的条件下进行了MTT实验、平板克隆实验和软琼脂克隆实验,结果表明,彻底去除雄激素后,敲低SGEF的表达依然能够抑制前列腺癌细胞雄激素非依赖的生长、存活能力和恶性程度。Bicalutamide是重要的雄激素拮抗药物,我们在bicalutamide处理的条件下进行了MTT实验、平板克隆实验和软琼脂克隆实验,结果表明,敲低SGEF能够增加bicalutamide对前列腺癌细胞的生长抑制能力。这些结果显示,SGEF在前列腺癌雄激素非依赖型生长中发挥着重要作用。AKT信号通路在前列腺癌的恶性进程中发挥着重要的作用,异常激活的AKT信号通路通过调控肿瘤细胞的增殖、存活、血管发生、侵袭和转移促进前列腺癌的恶性进程。我们检测了敲低SGEF的表达对AKT信号通路的影响,结果发现,敲低SGEF的表达能够降低前列腺癌细胞中AKTser473位点磷酸化水平,初步揭示了SGEF促进前列腺癌进展的分子机制。雄激素受体(androgen receptor,AR)在前列腺癌的发生发展中具有至关重要的作用,是公认的内分泌治疗的靶标及预后的重要指标,然而临床中出现的术后复发、抗雄激素药物耐受和前列腺癌骨转移等使我们意识到前列腺癌的复杂性。因此发现新的AR共调节因子对于揭示前列腺癌的发生、发展及转移机制,以及发现新的早期诊断指标和新的药物靶标均具有重要意义。我们发现,SGEF能够以剂量和激素依赖的方式抑制AR的转录活性,且这种抑制效应依赖于其鸟苷酸交换酶活性及自身结构的完整性。我们随后发现SGEF能够抑制前列腺癌细胞中PSA的表达,进一步证明了SGEF能够抑制AR的转录活性。对SGEF蛋白序列进行分析后发现SGEF的DH结构域中具有一个“LXXLL motif”,已经发现这个基序在一些AR共调节因子中介导共调节因子与AR之间的相互作用,这提示我们SGEF与AR之间可能存在相互作用。于是我们进行了GST-pull down实验,初步发现了SGEF能够与AR发生相互作用。激光共聚焦实验结果显示,AR能够调控SGEF进入细胞核,在细胞核内SGEF与AR共定位。这些结果初步揭示了SGEF有可能作为一种新型的AR共抑制因子在前列腺癌的发生发展进程中发挥一定的作用。本研究首次发现了鸟苷酸交换因子家族成员SGEF在前列腺癌细胞和组织中的表达高于正常前列腺癌细胞和组织,且发现SGEF能够促进前列腺癌进展及雄激素非依赖转化,并初步发现了其发挥作用的分子机制。同时,本研究SGEF能够抑制AR的转录活性,且初步证明了SGEF与AR之间存在相互作用,提示及SGEF有可能是一种新型的AR共抑制因子。这些研究结果为发现前列腺癌进展相关新的信号通路分子及新的药物靶标奠定了基础。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-15
材料与方法  15-20
  1. 材料  15-16
  2. 方法  16-20
第一部分 SGEF 在前列腺癌进展中的作用  20-34
  1.1 SGEF 在细胞和临床标本中的表达研究  20-23
  1.2 降低SGEF 的表达抑制前列腺癌细胞的生长和存活能力  23-26
  1.3 SGEF 表达促进前列腺癌细胞雄激素非依赖的生长和存活能力  26-27
  1.4 降低SGEF 的表达能增强雄激素拮抗剂bicalutamide 对前列腺癌细胞的生长和存活抑制能力  27-28
  1.5 降低SGEF 的表达抑制前列腺癌细胞的迁移能力  28-29
  1.6 降低SGEF 的表达抑制AKT 信号通路  29-31
  讨论  31-34
第二部分 SGEF 抑制AR 的转录活性  34-46
  2.1 过表达SGEF 抑制AR 的转录激活作用  34-35
  2.2 SGEF 抑制AR 的转录激活作用具有剂量依赖效应  35
  2.3 SGEF 以激素依赖方式抑制AR 的转录激活作用  35-36
  2.4 敲低SGEF 能够增强AR 的转录激活作用  36-37
  2.5 SGEF 抑制PSA-LUC 的转录是AR 依赖的  37-38
  2.6 SGEF 对AR 转录激活作用的影响依赖于SGEF 自身结构的完整性  38-39
  2.7 SGEF 对内源性AR 靶基因PSA 表达的影响  39-40
  2.8 体外GST pull-down 实验验证SGEF 与AR 存在相互作用  40-41
  2.9 SGEF 与AR 在细胞核中共定位  41-44
  讨论  44-46
结论  46-47
参考文献  47-53
附录  53-54
文献综述  54-61
  参考文献  57-61
个人简历  61-62
致谢  62

SGEF在前列腺癌进展中的作用和功能研究

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