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抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的制备与功能的研究

作　者: 樊红艳
导　师: 陈薇; 于长明
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 前列腺干细胞抗原前列腺癌单克隆抗体
分类号: R737.25
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

前列腺癌在全球新发恶性肿瘤中居第二位，在发达国家中则位于第一位。我国前列腺癌的检出率上升很快，应该受到重视。前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)是Reiter等发现的一种前列腺癌相关蛋白，是表达在前列腺上皮细胞表面的含123个氨基酸残基的GPI锚定蛋白。由于PSCA具有较高的前列腺组织特异性，其蛋白质分子锚定在细胞表面而非分泌形式，因此PSCA可作为前列腺癌诊断及免疫治疗的潜在靶标而受到广泛关注。本研究的目标是基于国内外的研究现状和本室的研究基础，期望研制抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体。研究内容包括，首先采用杂交瘤技术制备抗人前列腺干细胞抗原的单克隆抗体，然后进行筛选以得到结合细胞表面PSCA活性的单克隆抗体，再在小鼠模型中评价其抑瘤活性和建立诊断前列腺癌的免疫组化方法。同时，扩增抗体的可变区基因，进行单链抗体的相关研究。对于抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的制备，抗原的选择与制备是筛选得到活性抗体的关键。首先根据文献选取PSCA分子全长的21-101位氨基酸，构建了含GST标签和His标签的PSCA融合蛋白的原核表达质粒，GST可以增加可溶性，而His则便于纯化。在大肠杆菌中表达了PSCA融合蛋白，亚细胞定位实验显示，表达产物主要以可溶形式存在。超声后取上清纯化，经过两步纯化(GST柱和Ni柱)得到较高纯度的PSCA融合蛋白。并且用抗GST、抗His和抗PSCA抗体进行Western印迹验证了目的蛋白的表达。以PSCA融合蛋白为抗原，以杂交瘤技术获得了6株抗人PSCA单克隆抗体。测定了各株抗体的效价、亚类(型)，并用PSCA标准品(Abnova)通过ELISA、Western印迹验证了抗人PSCA单克隆抗体的特异性。随后进行多种细胞的流式实验，包括P815-PSCA(表达PSCA的小鼠肥大细胞)、LNCaP(激素依赖的人前列腺癌细胞)、PC-3(激素非依赖的人前列腺癌细胞)和DU-145(激素非依赖的人前列腺癌细胞)，以验证PSCA单克隆抗体能够与这些细胞结合。P815-PSCA细胞是本室建立的表达PSCA的细胞，另3种细胞据文献报道也有PSCA表达。最终筛选得到3株(19#、24#、31#)具有结合细胞表面PSCA活性的单克隆抗体，并且在4种细胞上具有相似的结合特性。用PC-3细胞和DU-145细胞进行了Western印迹分析，得到与商品化PSCA兔多抗一样大小的条带，约18kDa，为进一步研究和应用打下基础。为评价PSCA单克隆抗体的体内抑瘤活性，我们选用激素非依赖性前列腺癌细胞系DU-145作为研究对象。DU-145细胞系来源于一名未治疗的前列腺癌白人男性，现已被广泛使用。它的特性较清楚，它具有小鼠的致瘤性，不表达PSA或雄激素受体，接近于激素非依赖的前列腺癌，可用于构建代表进展期的前列腺癌的模型。首先通过激光共聚焦实验观察到PSCA单克隆抗体在4℃能够结合于DU-145细胞表面，在37℃可内化进入胞内。在光镜下观察了PSCA单克隆抗体对DU-145细胞生长的影响，并用MTT法测定细胞活度，结果显示PSCA单克隆抗体具有一定的抑制作用。我们应用DU-145建立了裸鼠荷瘤模型以评价PSCA单克隆抗体的体内抑瘤活性。将DU-145细胞注射到裸鼠背部以建立人前列腺癌小鼠荷瘤模型，结果显示，注射1×106个细胞/只的实验组小鼠全部成瘤，并且经过组织病理学检查，确认为癌组织，结果表明成功建立了DU-145细胞裸鼠致瘤动物模型。在DU-145细胞裸鼠致瘤动物模型中进行了PSCAmAb的抑瘤实验。在实验过程中，裸鼠肿瘤体积均在增大，注射抗体组的肿瘤形成时间较PBS组推迟约2周，在注射抗体40天后，31号抗体组的肿瘤平均体积与PBS对照组经过t检验，结果显示存在显著性差异(P<0.05)，19号抗体和24号抗体组则无，提示PSCAmAb31#具有一定的应用前景。为建立PSCAmAb用于临床标本前列腺癌的病理诊断的免疫组化方法，我们首先在荷瘤小鼠的肿块标本上进行了免疫组化实验，PSCAmAb表现出较强的阳性反应，癌细胞膜和细胞浆着色均较深，表明PSCAmAb对于荷瘤裸鼠的癌组织具有很强的结合。临床前列腺癌的病理诊断一般进行Gleason评分。Gleason总分为1~4的肿瘤临床上较为少见，大部分肿瘤的Gleason总分为5~10，而以6、7者最为常见，有关前列腺癌的研究所用病例的Gleason总分亦多为6和7。本研究中，4例临床标本按Gleason评分分别为6、7、8和10，具有一定的代表性。不同Gleason评分的原发性前列腺癌PSCA染色均呈中度到强度染色，少部分染色较浅，阳性染色区域位于细胞膜、胞浆，染色范围较宽。与正常前列腺组织相比，染色强度及范围在前列腺癌组织中差异较明显；不同Gleason评分的前列腺癌组织中，PSCA染色强弱不等，在本研究中，PSCA染色与前列腺癌评分基本一致。前列腺癌临床标本的免疫组化结果显示PSCA mAb可以特异地结合癌细胞，显示出较好特异性和敏感性，初步建立PSCAmAb诊断前列腺癌的免疫组化方法。为进一步对PSCAmAb进行基因工程抗体改造，我们采用5’RACE法克隆了3株抗体(19#、24#、31#)的可变区基因，并对抗体可变区基因的序列进行了生物信息学分析，包括BLAST同源性比较，IMGT V区分析、SignalP信号肽分析。结果显示，确实获得了抗体可变区的序列，并划分了前导肽、框架区和互补决定区。在此序列基础上，以31号抗体为例，以VL-linker-VH形式构建单链抗体(scFv)，并利用SWISS-MODEL进行了三维结构的预测，结果显示scFv为典型的抗体的三维结构。根据二硫键设计原则，选取H链第44位和L链104位氨基酸突变为半胱氨酸以设计二硫键稳定的单链抗体(dsFv)，并进行三维结构的预测和验证，结果显示dsFv形成了预期的链内二硫键，有助于提高其稳定性。随后，构建了带His标签的scFv和dsFv的原核表达质粒，在大肠杆菌中进行了诱导表达，亚细胞定位实验显示，表达产物主要以包涵体的形式存在，超声后的包涵体经洗涤、变性后经过Ni柱纯化，最后经梯度透析、复性得到了单链抗体，SDS-PAGE和Western印迹分析结果表明，复性后的dsFv形成了预期的链内二硫键。以商品化PSCA蛋白(Abnova)为抗原，以ELISA法验证了scFv和dsFv的结合活性，为进一步基因工程抗体改造奠定了实验基础。本研究制备、筛选得到了抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体，并且具有较高的病理诊断和治疗的潜在应用价值。抗体可变区基因的获得与dsFv的成功设计为PSCA mAb后续的基因工程抗体打下良好基础。

全文目录

主要缩略词表  4-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-15
第一部分 PSCA 重组蛋白的表达与纯化  15-20
  1 材料  15
  2 方法  15-17
  3 结果  17-19
  4 讨论  19-20
第二部分 PSCAmAb 的制备、鉴定与筛选  20-32
  1. 材料  20
  2. 方法  20-24
  3 结果  24-30
  4 讨论  30-32
第三部分 PSCAmAb 抑瘤活性的研究  32-40
  1 材料  32
  2 方法  32-34
  3 结果  34-38
  4 讨论  38-40
第四部分 PSCAmAb 诊断前列腺癌的免疫组化方法建立的研究  40-49
  1．材料  40
  2．方法  40-41
  3.结果  41-48
  4 讨论  48-49
第五部分 PSCAmAb 可变区基因的克隆与单链抗体的的研究  49-70
  第一节 PSCA mAb 可变区基因的 5’RACE 扩增及序列分析  49-58
  第二节单链抗体的设计、表达、制备和活性研究  58-70
结论  70-71
参考文献  71-74
附录主要溶液配制  74-76
综述  76-85
  参考文献  81-85
论著一  85-89
论著二  89-94
个人简历  94-95
致谢  95

抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的制备与功能的研究

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