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角质细胞特异性过表达miR-142转基因小鼠的建立

作　者: 孙耀兰
导　师: 杨晓
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: miR-142 角质细胞转基因小鼠创伤愈合
分类号: R641
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

皮肤创伤愈合是一个复杂目‘有序的过程，包括止血和炎性反应、重上皮化及肉芽组织的形成、组织重塑二个阶段，二个阶段互相交叉，难以截然分开。目前越来越多关十microRNA C miRNA)在皮肤发育以及毛囊发生过程中的研究，miRN A是内源性表达的，长度为21 }-24核若酸的单链RNA分子，能识别靶基因mRN A的3’非翻译区(3’-UTR)并通过抑制翻译或影响mRN A稳定性Ifu于印制靶基因的表达。miRNA参与多种信号通路的调节并在多种生物学过程中具有广泛和重要的生理功能，但是参与皮肤创伤愈合的miRN A的研究很少，我们选择研究的miR-142基因定位十17号染色体，在胸腺和脾脏中表达较高，主要功能是参与造血以及机体免疫，但是miR-142是否在皮肤发育以及创伤愈合中是否发挥作用，尚未见相关报道。首先我们使用Northern Blot检测了miR-142在小鼠各组织器官中的表达谱，结果显示，miR-142在胸腺表达较高，胸腺为机体重要的淋巴器官，功能与免疫紧密相关，提示miR-142的主要功能可能是参与机体免疫，miR-142在正常皮肤中也有表达。为了验证miR-142是否在皮肤创伤愈合过程中发挥作用，我们取创伤后1-5天皮肤创缘组织通过Northern Blot发现创伤后1天表达明显升高，一直持续到创伤后5天。这一结果提示miR-142可能在皮肤创伤愈合发挥重要作用。为了深入分析miR-142在皮肤创伤愈合中的作用，我们在HaCaT细胞过表达miR-142，观察其刘一细胞增殖和细胞迁移的影响，通过MTT细胞生长曲线实验发现miR-142抑制HaCaT细胞增殖，我们进一步研究了miR-142刘一细胞周期的影响，发现HaCaT细胞中转染miR-142 mimic后，S期细胞比例显著减少。通过细胞划伤实验显示HaCaT细胞转染miR-142 mimic后与刘一照相比迁移变慢，IfUb_ Transwell实验也显示HaCaT细胞转染miR-142 mimic后穿过Milicell细胞培养小室的细胞与刘一照相比明显减少。以上结果显示miR-142抑制HaCaT细胞迁移。我们还利用生物信息学分析软件Targetscan预测miR-142的可能的靶基因，并利用Western Blot验证了候选靶基因(Pten, Smad4, Smad2以及cyclin D 1不I Icyclin E2)的表达。结果显示过表达miR-142可以使cyclin D 1表达降低。为了更进一步研究miR-142在皮肤发育和皮肤创伤愈合的作用，我们利用PCR扩增了6.3kb的人KS启动子，构建了在皮肤角质细胞特异性过表达miR-142的转基因载体，通过显微注射的方法获得了7只皮肤角质细胞特异性过表达miR-142的转基因首建者小鼠，Northern blot检测证实miR-142在转基因小鼠皮肤中特异性过表达。我们刘一6周龄转基因小鼠进行HE染色以及利用表皮层的不标记分子进行免疫组织化学分析，K14为基底层角质细胞的标记分子，Involucrin为成熟角质细胞的标记分子，结果发现转基因小鼠的表皮、毛囊及真皮发育正常。综上所述，本研究揭示了皮肤创缘组织miR-142在创伤后表达升高，并目‘HaCaT细胞中过表达miR-142使cyclin D 1的表达降低，从Ifu于印制HaCaT细胞的增殖，HaCaT细胞中过表达miR-142后细胞迁移减慢，预示miR-142在皮肤创伤愈合中发挥重要作用，十是我们建立了皮肤角质细胞特异性过表达的转基因小鼠，从Ifu为体内研究miR-142在皮肤创伤中的作用提供了很好的模型。

角质细胞特异性过表达miR-142转基因小鼠的建立

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