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EPAS1基因单核苷酸多态性与男性汉族高原红细胞增多症的相关性研究

作　者: 陈郁
导　师: 高钰琪
学　校: 第三军医大学
专　业: 高原医学
关键词: 高原红细胞增多症内皮PAS蛋白1基因单核苷酸多态性高分辨率熔解曲线分析
分类号: R594.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景和目的平原人进入高原低氧环境时，红细胞代偿增加，改善低氧血症，但是在部分个体中红细胞出现过度增生，血红蛋白(hemoglobin, Hb)浓度显著增加，最终发展为高原红细胞增多症(high altitude polycythemia, HAPC)，导致机体血液粘滞度增加，血流缓慢，微循环灌注不良，反而加重机体低氧血症。本病临床特征主要表现为红细胞和血红蛋白过度增多以及低氧血症引起的多系统、多器官损害，其中以呼吸系统，心血管系统以及神经系统表现特别明显。高原红细胞增多症在高原世居者和平原移居者均可发生，但高原世居人群罹患者较少，而高原移居人群发病率显著上升。男性发病率显著高于女性，海拔与发病率存在明显正相关，即海拔越高发病率也越高，其血液学特征为男性血红蛋白浓度≥210g/L，女性≥190g/L。本病主要表现为红细胞数量增多，但其具体机制尚未阐明，而高原世居藏族低Hb浓度生理特点的调控机制为我们探索移居汉族HAPC的发病机制提供了线索。藏族被认为是全世界对高原环境适应最好的民族，其适应的重要标志之一就是低血红蛋白浓度。与同海拔的移居汉族相比，高原世居藏族血红蛋白浓度显著为低，即便良好习服的移居汉族，其血红蛋白浓度亦明显高于同海拔的藏族，但藏族低血红蛋白浓度的具体机制尚未阐明。基因芯片以及外显子测序等高通量技术的快速发展，为藏族高原适应遗传机制的研究提供了全新的技术手段。采用这些先进的技术方法，对藏族高原适应的遗传机制研究有了重大进步。新近的研究结果显示,高原世居藏族EPAS1基因和EGLN1基因DNA序列的某些位点与平原汉族存在显著的频率差异，并且这些差异位点与高原世居藏族的低血红蛋白浓度显著相关，其中EPAS1基因关联性更强。前期研究发现EPAS1基因的外显子突变在平原环境下即可导致红细胞过度增生，提示EPAS1基因在调控血红蛋白浓度中起着重要作用。由此推测，EPAS1基因可能参与了汉族高原红细胞增多症的发生。因此，本研究通过选择EPAS1基因中藏-汉频率差异显著的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点，在高原地*本课题受国家科技支撑计划(2009BAI85B01)；国家重点基础研究发展计划(“973”计划，No.2012CB518201)资助。区移居汉族人群中，检测男性高原红细胞增多症患者以及健康对照上述SNP位点的基因型分布，对其多态性进行分析，旨在探讨EPAS1基因SNP与男性汉族高原红细胞增多症的相关性。材料与方法2009年至2011年期间，在青藏高原海拔4000米以上地区调查过程中，通过收集受试者流行病学资料和临床基本资料以及测定外周静脉血Hb浓度，我们获得了318例男性汉族高原红细胞增多症患者标本，并筛选出年龄、工作地海拔、高原居住时间以及籍贯相一致的高原健康对照组316例。使用全血基因组提取试剂盒提取DNA，结合已发表的藏族DNA数据和HapMap数据库中北京汉族资料，最终挑选出EPAS1基因五个SNP位点(rs13419896, rs1868092, rs4953354, rs6756667, rs7583392)。采用聚合酶链式反应-高分辨率熔解曲线分析(polymerase chain reaction-high resolution melting,PCR-HRM)的方法进行基因分型，分型完成后对分型结果随机抽取10%进行DNA测序以检验分型结果的准确性。采用卡方检验分析上述五个SNP位点在病例组和高原健康对照组之间的基因型分布和频率分布，非条件logistic回归分析各个基因型的发病风险，并与已经发表的藏族数据和HapMap数据库相对比。结果1. rs7583392的基因型分布在高原健康对照组中不满足哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)(p<0.05)，其数据不纳入后续分析。2. rs13419896,rs1868092和rs4953354的基因型分布以及等位基因分布在男性汉族HAPC组和高原健康对照组之间无明显差异（p>0.05）。3. rs6756667位点的基因型分布在男性汉族HAPC组和高原健康对照组中存在显著差异(p=0.049)，其等位基因分布亦存在显著差异(p=0.01)。GG基因型的频率高于高原健康对照组，GG、AG基因型在男性汉族HAPC组与高原健康对照组之间的分布存在显著差异(p=0.025)。以G等位基因为参照，A等位基因是男性汉族HAPC的保护因素(OR=0.65,95%CI=0.46-0.91)。4.非条件logistic回归分析显示，在SNP位点rs6756667中，以GG基因型为参照，AG基因型降低男性汉族HAPC的发病风险(OR=0.64,95%CI=0.43-0.95)，AA与AG基因型对男性汉族HAPC的发病具有保护效应(OR=0.62,95%CI=0.43-0.91)。在SNP位点rs13419896和rs1868092中，以AA基因型为参照，AG与GG基因型并未增加男性汉族HAPC的发病风险；rs4953354，以GG基因型为参照，AA与AG基因型并未增加男性汉族HAPC的患病风险。5. rs13419896,rs1868092和rs4953354构建的G-G-G单倍型在男性汉族HAPC组和高原健康对照组中分布存在显著差异(p=0.003)，G-G-G单倍型是男性汉族HAPC的危险因素(OR=2.046，95%CI=1.264-3.309)。6.首次发现了HapMap数据库北京汉族未报道的rs1868092的AA基因型和rs4953354的GG基因型。结论汉族EPAS1基因中存在HAPC的易感位点，rs6756667与男性汉族HAPC发病相关，其A等位基因是男性汉族HAPC的保护因素；rs13419896, rs1868092和rs4953354构建的G-G-G单倍型是男性汉族HAPC的危险因素，提示EPAS1基因参与了汉族HAPC的发生。

EPAS1基因单核苷酸多态性与男性汉族高原红细胞增多症的相关性研究

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