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组织工程化培养模型下力学载荷与植物雌激素联合调控小鼠前成骨细胞及骨重建机制的研究

作　者: 刘璐
导　师: 张西正
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 力学载荷成骨细胞三维培养植物雌激素复合支架动态培养
分类号: R58
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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引　用: 2次
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内容摘要

研究背景和目的：骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种代谢性疾病，其特征是骨量下降和骨的微细结构破坏，表现为骨的脆性增加，因而骨折的危险性大为增加。随着我国乃至全球老年人口的增加，骨质疏松症发病率处于上升趋势，被世界卫生组织列为中老年三大疾病之一。OP主要发病机制是机体的骨重建失衡。当破骨细胞（osteoclast, OC）行使的骨吸收作用大于成骨细胞（osteoblast，OB）行使的骨形成作用时就会发生OP。骨重建是一个多因素参与的复杂过程，力学载荷和雌激素都是影响其主要因素。实验探讨植物雌激素α-玉米赤酶醇（α-Zearalanol，α-ZAL）为代表的化学信号和以力学载荷为代表的物理信号耦合作用对骨重建的影响，通过建立二维和三维，组织工程化培养模型，考察OB对这两种不同信号的生物学响应机制。研究结果为战伤骨折救治提供了理论基础，也为预防OP，由“被动医疗”转向“主动健康”提供临床参考。因此，研究工作对于相关骨疾病的治疗与康复进行了有意义的探索。研究方法：1.传代培养小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1，采用不同浓度α-ZAL作用于细胞72h后，MTT法检测细胞增殖活性，PNPP法检测ALP活性，RT-PCR检测ALP、OPG及RANKL mRNA的表达水平；2.采用四点弯曲力学加载装置，选择频率为0.5Hz,强度1000με和2500με的力学拉伸应变作为力学加载组，α-ZAL(10^-6、10^-8、10^-10M)作为药物作用组，对MC3T3-E1细胞进行单独作用及联合作用。力学加载方式为1次/d，1h/次。细胞处理72h后，采用流式细胞术检测细胞增殖情况；PNPP法检测ALP活性；real time RT-PCR检测ALP、Runx2、OPG及RANKL mRNA的表达水平；Western blot分析方法检测RUNX2、OPG及RANKL蛋白表达；3.壳聚糖与透明质酸进行交联改性，改性后与胶原按不同比例制备三种改性壳聚糖/胶原/羟基磷灰石复合支架；对改性后的壳聚糖进行红外和差示扫描量热图谱进行结构分析；考察复合支架的孔径、孔隙率、密度、力学强度等理化性质；支架接种细胞后考察细胞生长曲线并进行HE染色等形态学观察；4.应用动态载荷与循环灌流反应器培养细胞-支架复合物。CCK-8法检测三种不同流速（5,10,20ml/min）和3500με力学压载（1Hz,2h/d）的力学环境下成骨细胞的增殖能力；SEM考察细胞支架复合物表面和内部细胞的分布及形态；免疫组化染色和Western blot分析法考察细胞分化标志蛋白表达情况。Von Kossa矿化结节染色法考察细胞支架复合物动态培养矿化情况；5.在三维动态培养细胞支架复合物体系中加入不同浓度的α-ZAL(10^-6、10^-8、10^-10M)，CCK-8法检测增殖，PNPP法检测ALP活性，Western blot分析OPG，RANKL蛋白表达。实验结果：1.10^-6-10^-12M α-ZAL可显著抑制成骨细胞的增殖（P<0.05）；10^-6-10^-12M α-ZAL均可使ALP活性增加（P<0.05），但不同剂量间存在作用时间差异。10^-6-10^-10M α-ZAL均可上调成骨细胞内OPG/RANKL mRNA的比值（P<0.05）；2.力学拉伸单独作用于成骨细胞可促进细胞增殖，ALP活性以及RUNX2蛋白表达，并可以提高OPG/RANKL比值。虽然力学载荷与α-ZAL耦合后仍然抑制成骨细胞增殖，但高浓度α-ZAL(10^-6M)耦合高强度拉伸应变（2500με）能够显著提高ALP活性；α-ZAL耦合高强度拉伸应变能够显著上调RUNX2蛋白表达。α-ZAL耦合低强度拉伸应变（1000με）可显著上调OPG/RANKL比值；3.红外和差示扫描量热图谱证明透明质酸和壳聚糖以酰胺键形成交联的新化合物；扫描电镜显示孔径在50-250m之间，孔隙率分别为46.2±1.88，50.4±5.14，62.5±4.53（%）；密度分别为0.1049±0.24，0.0921±8.01，0.0509±5.34（g/ml）；弹性模量分别为：1.51±0.19，29.31±0.38，36.94±0.25（KPa）；生长曲线结果：前7天B、C样品中活细胞数量明显高于A样品，从第10d开始，三种样品中细胞数量相差不大，均出现平台期；HE染色发现成骨细胞在培养初期沿着支架材料内部空隙贴壁生长，随着培养天数的增加，贴壁细胞呈集落样生长，可明显看到细胞间连接；4.利用生物反应器动态培养细胞支架复合物，选择灌流流速为10ml/min显著促进MC3T3-E1细胞增殖；支架接种细胞并且动态培养5d后，细胞黏附于支架壁呈梭形和不规则形状，伸出伪足，分泌少量的绒毛和ECM； COLI、OPN和OCN的免疫组化染色均为阳性；Western blot分析结果动态培养7d时COLI的表达量显著上调；OPN的表达显著下降；OCN在体外培养12d后表达量没有发生改变；5.高浓度α-ZAL抑制三维动态培养成骨细胞增殖，并促进ALP活性的增加。通过上调OPG蛋白表达，下调RANKL蛋白表达而增加OPG/RANKL比值。结论：1. α-ZAL为新近发现一类植物雌激素，对成骨细胞活性的影响尚未见文献报道。研究发现α-ZAL可抑制成骨细胞的增殖、促进分化，并可通过上调OPG/RANKL mRNA表达比值抑制破骨细胞的活化，有望成为OP的治疗药物；2.拉伸应变可有效促进成骨分化，且具有强度依赖性；当与化学信号耦合，能进一步上调成骨细胞分化能力；但低强度拉伸应变耦合α-ZAL通过上调OPG/RANKL比值更有利于抑制破骨细胞活化，调节骨重建；3.透明质酸改性壳聚糖/胶原/纳米羟基磷灰石复合材料作为一种新型有机无机复合支架材料，有利于促进成骨细胞黏附、增殖，同时也可为三维药物筛选提供良好平台；4.生物反应器的研发与应用成为三维培养不可缺少的技术平台。应用自主研发的循环灌流和动态压载反应器可实现组织工程骨的体外培养。研究发现流速10ml/min联合3500με压应变的参数条件较适合细胞支架复合物的动态培养。OB在HA-CS/Col/nHAP复合支架上动态培养可上调或维持其成骨功能；5.骨组织工程化培养模型下α-ZAL可作为新型成骨促进因子，有利于OB分化；通过提高OPG/RANKL比值抑制骨吸收，从而促进成骨。6.二维培养和三维培养模式下OB对不同性质信号表现出不同的生物学响应。骨组织工程化模型作为体外构建与体内相似的培育环境的技术平台，提供更加符合OB生存的物理环境，更真实的勾勒OB对药物与力学载荷耦合信号的响应机制。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
第一章绪论  13-27
  1 研究的背景  13-20
  2 研究的目的和意义  20
  3 研究内容与研究方法  20-22
  4 课题实施方案  22
  参考文献  22-27
第二章植物雌激素α-ZAL 对 MC3T3-E1 细胞成骨活性的影响  27-39
  1 材料和方法  28-33
  2 实验结果  33-36
  3 讨论  36-37
  本章小结  37
  参考文献  37-39
第三章二维培养模型下拉伸应变与α-ZAL联合调控MC3T3-E1细胞的作用机制  39-68
  1 材料与方法  40-47
  2 实验结果  47-61
  3 讨论  61-64
  本章小结  64-65
  参考文献  65-68
第四章三维和组织工程化培养模型下力学载荷与植物雌激素联合调控成骨细胞的作用机制  68-98
  第一节透明质酸改性壳聚糖/胶原/羟基磷灰石复合支架的制备及理化性能表征  68-78
    1 材料和方法  69-71
    2 实验结果  71-75
    3 讨论  75-78
  第二节 HA-CS/Col/nHAP 复合支架体外三维动态培养成骨细胞 MC3T3-E1  78-89
    1 材料和方法  78-83
    2 实验结果  83-87
    3 讨论  87-89
  第三节骨组织工程化模型下植物雌激素α-ZAL 对骨重建作用机制的影响77  89-94
    1 材料与方法  89-92
    2 实验结果  92-93
    3 讨论  93-94
  本章小结  94
  参考文献  94-98
全文总结  98-100
文献综述  100-104
在学期间取得的成果及发表的代表性论著  104-115
作者简历  115-116
博士期间发表的文章  116-117
致谢  117

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