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Toll样受体3抑制胰岛β细胞生长机制研究

作　者: 王怡
导　师: 郭军
学　校: 南京医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: TLR3 细胞周期 胰岛β细胞 细胞周期蛋白 JNK
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：Toll样受体家族(Toll-like receptors, TLRs)参与了包括2型糖尿病在内的多种与炎症相关疾病的发病过程。研究表明，TLRs与2型糖尿病的外周组织胰岛素抵抗密切联系。然而TLRs，尤其是Toll样受体3(TLR3)对机体胰岛β细胞整体功能的调节作用并不清楚。本研究旨在探讨TLR3对胰岛β细胞增殖的调控机制。方法：采用高糖高脂(16.7mM葡萄糖+0~0.4mM棕榈酸(palmitic acid))刺激胰岛β细胞系INS-1（大鼠）和NIT-1（小鼠），并提取糖尿病db/db小鼠的胰岛，建立胰岛β细胞体外和体内糖尿病模型。实时定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术分别检测糖脂毒性刺激胰岛β细胞，TLR3的mRNA和蛋白水平及其下游信号分子IRF-3蛋白表达的变化；给予聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid, poly (I:C))激活TLR3；噻唑蓝(MTT)法、EdU荧光标记、Hoechst33258染色和流式细胞术分别评价胰岛β细胞的生长活力，细胞增殖、凋亡以及周期进程的变化；转染TLR3的特异性小干扰RNA(TLR3-siRNA)、或给予26S蛋白酶体和c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂MG132和SP600125；Real-time RT-PCR和Western blot实验分别检测细胞周期蛋白cyclin D1、D2、D3、和E、p18和p27的mRNA和蛋白水平。结果：糖脂毒性能显著上调胰岛β细胞TLR3及其下游信号分子IRF-3的蛋白水平；TLR3的激活导致胰岛β细胞生长活力、增殖能力下降，凋亡增加，以及细胞周期阻滞于G1期；采用特异性siRNA下调TLR3，能明显改善胰岛β细胞的周期阻滞；同时，TLR3的激活对cyclin D1、D2、D3、和E、p18以及p27的mRNA水平均无显著影响，但诱导cyclin D1和D2蛋白含量显著下调；蛋白酶体抑制剂MG132预处理，能拮抗cyclin D1和D2蛋白表达下调；给予SP600125抑制poly (I:C)诱导的JNK激活，并不能缓解TLR3调控的细胞周期阻滞。结论：糖脂毒性能显著上调胰岛β细胞TLR3固有免疫信号通路。不同程度的TLR3激活能促进胰岛β细胞凋亡，也能通过诱导细胞G1期阻滞，抑制胰岛β细胞增殖。该增殖抑制过程与周期蛋白cyclin D1和D2的表达下调密切联系，而可能与JNK信号途径无关。泛素-蛋白酶体介导的蛋白降解而非其基因转录抑制是cyclin D1和D2含量减少的重要因素。以上研究揭示了TLR3通过促进胰岛β细胞损伤及阻断其细胞增殖，诱导其数量减少，参与机体胰岛β细胞整体功能障碍调控，继而为2型糖尿病的临床治疗提供新的途径和药物靶点。

全文目录


中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-16
材料和方法  16-33
  1. 实验材料与试剂  16-18
    1.1 细胞系  16
    1.2 实验动物  16
    1.3 仪器设备  16-17
    1.4 实验试剂  17-18
  2. 研究方法  18-33
    2.1 细胞培养  18
    2.2 棕榈酸盐(Palmitate)及其他相关药物配制  18-19
    2.3 小鼠胰岛细胞的分离和培养  19-21
      2.3.1 胰岛β细胞的分离与纯化  19-20
      2.3.2 胰岛细胞的鉴定  20-21
      2.3.3 原代胰岛β细胞的培养  21
    2.4 总 RNA 的提取  21-22
      2.4.1 提取总 RNA  21
      2.4.2 紫外定量和检测  21
      2.4.3 琼脂糖凝胶电泳  21-22
    2.5 Real-time RT-PCR  22-24
      2.5.1 cDNA 的合成  22-23
      2.5.2 相关引物合成  23-24
      2.5.3 Real-time RT-PCR 反应  24
    2.6 蛋白质的抽提及浓度测定  24-26
      2.6.1 提取总蛋白  24-25
      2.6.2 抽提核蛋白  25
      2.6.3 BCA 试剂盒测定蛋白浓度  25-26
    2.7 免疫印迹(Western blot)  26-29
      2.7.1 蛋白变性  26
      2.7.2 蛋白电泳  26-28
      2.7.3 转膜（半干转）  28
      2.7.4 封闭  28-29
      2.7.5 抗体孵育  29
      2.7.6 ECL 检测  29
    2.8 MTT 法  29
    2.9 Hoechst 33258 染色检测细胞凋亡  29-30
    2.10 EdU 荧光标记细胞增殖实验  30-31
    2.11 RNAi  31-32
      2.11.1 siRNA 片段的合成  31
      2.11.2 siRNA 瞬时转染  31-32
    2.12 流式细胞术检测细胞周期  32
    2.13 数据处理  32-33
结果  33-38
  1. 糖脂毒性诱导胰岛β细胞 TLR3 表达上调  33
  2. TLR3 激活抑制胰岛β细胞的生长活力  33-34
  3. TLR3 激活剂促进胰岛β细胞凋亡  34
  4. TLR3 功能上调抑制胰岛β细胞增殖  34-35
  5. TLR3 激活参与调控胰岛β细胞周期 G1 期阻滞  35
  6. TLR3 激活导致胰岛β细胞周期相关蛋白 cyclin D1 和 D2 表达下调  35-36
  7. 泛素-蛋白酶体介导的蛋白降解途径参与调节 cyclin D1 和 D2 的表达下调  36
  8. Poly (I:C)诱导的胰岛β细胞增殖抑制不依赖 JNK 的激活  36-38
实验数据及英文注释  38-53
讨论  53-57
小结  57-58
参考文献  58-64
附录（一）综述  64-79
  参考文献  74-79
附录（二）缩略词表  79-81
附录（三）发表文章  81-82
致谢  82

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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