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肝病患者血浆中相关miRNA和mRNA的检测分析

作　者: 曲秋月
导　师: 郑晓飞
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: miRNA mRNA 血浆肝病
分类号: R575
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

microRNA(miRNA)是一类长约19-24nt的非编码内源性小分子RNA,在生物进化过程中高度保守,miRNA不编码蛋白,绝大多数miRNA可以通过与靶基因3,UTR区互补结合,抑制靶基因翻译成蛋白质,进而在细胞、组织甚至个体水平上影响生物体的生长发育,并参与多种疾病的发生发展。根据生物信息学预测,人类基因组内存在着上千个miRNA基因,调控基因组内1/3左右基因的表达。近年来,miRNA分子机制的快速发展不仅揭示了miRNA的生理功能,而且解释了多种疾病包括癌症相关miRNA的异常表达模式。研究发现健康人血液中存在有上百种miRNA,由于来自疾病组织的miRNA在血液中避开了内源核糖核酸酶的活性,具有相当的稳定性,而且这些miRNA在血液中的含量足够多,很有可能会在疾病的临床诊断中发挥重要作用。miRNA几乎参与了肿瘤发生及发展的每一步过程,因此miRNA在肿瘤的早期诊断、预警及治疗等方面均有良好的应用前景。本研究主要是为了寻求肝病血浆中异常表达的miRNA,利用本实验室建立的poly(A)加尾实时定量RT-PCR技术定量检测健康血浆及肝病患者血浆中相关miRNA的表达情况,目的是要比较肝病患者血浆与健康人血浆中相关miRNA的差异。本研究首先完善了TRI Reagent法提取血浆miRNA的实验流程,确定了本实验条件下合适的血浆用量以及血浆与TRI Reagent试剂比例。其次,定量检测了miR-21、miR-221、miR-224在健康人血浆及肝病患者血浆中的表达水平。再次,已有研究证实肝癌血浆中存在甲胎蛋白(AFP)mRNA、丙酮酸激酶(PKM2)mRNA和白蛋白(ALB) mRNA,所以本研究中同时关注了其在健康人血浆及乙肝肝硬化患者血浆中的表达情况。主要研究进展如下:1.完善了血浆miRNA提取实验流程。确定了血浆与TRI Reagent的比例为1:5时提取效果相对较好,血浆用量大于800μl时提取的总RNA适于血浆中miRNA加尾RT-PCR检测分析。2.检测发现miR-21、miR-221及miR-224在肝病患者血浆中的量明显高于健康人血浆。通过对肝病患者进行临床分型,统计分析表明miR-21、miR-221及miR-224在不同类型肝硬化患者血浆中的量高于健康人。3.分析临床检测指标与所检测的miRNA量之间的关系,发现所检测的miR-21、miR-221及miR-224除了与个别的临床检测指标相关外,与大多临床检测指标的相关性不大。4.在健康人血浆及乙肝肝硬化患者血浆中检测了AFP mRNA、PKM2 mRNA和ALB mRNA的表达水平,发现这三种mRNA在健康人血浆和乙肝肝硬化患者血浆中均存在差异性表达。5.分析检测的mRNA与临床检测指标间的相关性,通过非参数检验证实所检测AFP mRNA和PKM2 mRNA与临床检测指标间的相关性不大,而ALB mRNA与γ-谷氨酰基转移酶(GGT)及血清白蛋白(ALB)间具有相关性。总之,本研究采用实时定量PCR技术检测了肝病患者血浆中相关miRNA及mRNA的表达情况,重点关注了肝硬化患者血浆中相关miRNA和mRNA的表达水平变化,这为深入研究肝癌发生过程中血浆相关miRNA和mRNA的变化提供了依据。通过更加深入的大样本和长期随访研究将有可能发现肝癌早期预警的微RNA分子标志物。该项研究将有助于人们加深对肝脏疾病的了解。

全文目录

缩略语一览表  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-17
第一部分血浆 miRNA 提取方法的建立  17-24
  实验材料  17-18
  实验方法  18-19
  实验结果  19-21
  讨论  21-22
  小结  22
  参考文献  22-24
第二部分肝病患者血浆中miRNA 的检测  24-41
  实验材料  24-26
  实验方法  26-27
  实验结果  27-36
  讨论  36-37
  小结  37-38
  参考文献  38-41
第三部分肝硬化患者血浆中AFP、PKM2 和ALB mRNA 的检测与分析  41-54
  实验材料  41-42
  实验方法  42-43
  实验结果  43-51
  讨论  51-52
  小结  52
  参考文献  52-54
主要仪器与设备  54-55
综述  55-64
  参考文献  61-64
个人简历  64-65
致谢  65

肝病患者血浆中相关miRNA和mRNA的检测分析

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