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Nesfatin-1对大鼠胃粘膜细胞胃酸分泌的影响及机理研究

作　者: 李静慧
导　师: 李学良
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: nesfatin-1 组胺胃酸 H~+/K~+-ATP 酶
分类号: R573
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 62次
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内容摘要

Nesfatin-1是由日本学者最近发现的一种新的厌食肽，起源于核组蛋白-2（nucleobindin2，NUCB2），在人类、大鼠和小鼠间保持高度同源性。NUCB2/nesfatin-1最初发现表达于调节摄食的下丘脑和脑干核中，也表达于外周组织，尤其是胃肠道中。Nesfatin-1能够发挥多种生理作用，包括调节摄食量、调节葡萄糖代谢和应激反应等。有研究显示，NUCB2mRNA在大鼠胃粘膜层的表达量是其大脑组织的10倍，而且nesfatin-1主要与葛瑞林（ghrelin）、生长抑素和组氨酸脱羧酶共存于胃泌酸腺中。关于它在胃肠道中的作用，nesfatin-1能够延缓胃排空、保护胃粘膜和抑制胃肠动力，但是并未见关于nesfatin-1对胃酸分泌的研究。本研究探讨了nesfatin-1对大鼠胃粘膜细胞胃酸分泌的影响及机理研究。【目的】1.研究nesfatin-1对大鼠离体的胃粘膜细胞的基础酸分泌及组胺（histamine）诱导的酸分泌的影响；2.探讨nesfatin-1对大鼠离体的胃粘膜细胞的H⁺/K⁺-ATP酶mRNA和蛋白表达的影响；3.探讨nesfatin-1对大鼠离体的胃粘膜壁细胞超微结构的影响。【方法】1.酶解法分离大鼠胃粘膜细胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养细胞，细胞免疫荧光检测法鉴定细胞。2.14C-氨基比林法（14C-AP）检测nesfatin-1对大鼠胃粘膜细胞的基础酸分泌及组胺诱导的酸分泌影响。3. Real-Time PCR法及Western Blot法分别检测nesfatin-1在基础状态及组胺诱导的条件下，对胃粘膜细胞H⁺/K⁺-ATP酶α亚基、β亚基mRNA和蛋白表达的影响。4.透射电镜观察nesfatin-1对大鼠离体的胃粘膜壁细胞超微结构的影响。【结果】1.大鼠胃粘膜细胞的培养与鉴定（1）培养24h后，可见细胞贴壁生长；（2）细胞免疫荧光染色结果显示壁细胞与抗H/K-ATPase β亚基单抗结合，ECL细胞与抗组胺单抗结合，G细胞与抗胃泌素单抗结合，D细胞与抗生长抑素单抗结合，经FITC（fluorescein isothiocyanate）染色后，细胞质发现绿色荧光，细胞核经DAPI（4’,6-diamidino-2-phenylindole）染色发出蓝色荧光。2. Nesfatin-1对大鼠离体的胃粘膜细胞的基础酸分泌及组胺诱导的酸分泌的影响（1）浓度为10-2、10^-1μmol/L的nesfatin-1在1，2h能够抑制离体培养的大鼠胃粘膜细胞的酸分泌，抑制作用最强的时间点为2h，与对照组相比，差异有统计学意义（均**P<0.01）。（2）浓度为10^-1μmol/L的nesfatin-1与10-4mol/L的组胺共孵育时，可抑制组胺诱导的酸分泌，其中1h时，为其抑制组胺诱导的酸分泌的最佳抑制时间点，与对照组相比，差异有统计学意义（**P<0.01）。（3）浓度为10^-2、10^-1μmol/L的nesfatin-1能够抑制组胺（10-4mol/L）诱导的离体大鼠胃粘膜细胞的酸分泌，与对照组相比，差异有统计学意义（均**P<0.01）。3. Nesfatin-1对H⁺/K⁺-ATP酶mRNA和蛋白表达的影响（1）10^-1μmol/L的nesfatin-1在1，2，3h能够抑制H⁺/K⁺-ATP酶α亚基mRNA表达水平，其中2h的抑制作用最强，与对照组比较，差异有统计学意义（均**P<0.01）；浓度为10^-1μmol/L的nesfatin-1在1h,2h能够抑制H⁺/K⁺-ATP酶β亚基mRNA表达水平，2h的抑制作用最强，与对照组相比，差异有统计学意义（均**P<0.01）。Nesfatin-1作用胃粘膜细胞2h时，在10-4¹0^-1μmol/L浓度下呈剂量依赖性抑制H⁺/K⁺-ATP酶α亚基和β亚基mRNA表达水平，与对照组相比，差异有统计学意义（均**P<0.01）。10^-1μmol/L的nesfatin-1在1，2，3h能够抑制H⁺/K⁺-ATP酶α亚基蛋白表达水平，其中2h的抑制作用最强，与对照组比较，差异有统计学意义（均**P<0.01）；浓度为10^-1μmol/L的nesfatin-1在2h,3h能够抑制H⁺/K⁺-ATP酶β亚基蛋白表达水平,2h的抑制作用最强，与对照组相比，差异有统计学意义（均**P<0.01）。Nesfatin-1作用胃粘膜细胞2h时，在10-3¹0^-1μmol/L浓度下呈剂量依赖性抑制H⁺/K⁺-ATP酶α亚基和β亚基蛋白表达水平，与对照组相比，差异有统计学意义（均**P<0.01）。（2）浓度为10^-1μmol/L的nesfatin-1能够逆转10-4mol/l的组胺引起的H⁺/K⁺-ATP酶α亚基和β亚基mRNA及蛋白表达水平的升高，分别与对照组相比，差异有统计学意义（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。4. Nesfatin-1对大鼠胃粘膜壁细胞超微结构的影响Nesfatin-1(10^-1μmol/L)能够减少组胺（10-4mol/L）引起的壁细胞内分泌小管数量的增加，使微绒毛稀少、形态萎缩。【结论】Nesfatin-1可能是通过下调H⁺/K⁺-ATP酶α亚基、β亚基mRNA和蛋白的表达或改变壁细胞的超微结构，发挥对离体大鼠胃粘膜细胞的基础酸分泌及组胺诱导的酸分泌的抑制作用。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-14
材料  14-20
方法  20-28
结果  28-39
讨论  39-42
结论  42-43
参考文献  43-48
综述  48-62
  参考文献  57-62
个人小结  62-63
致谢  63

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